油用牡丹单粒种子含油量NIRS模型的建立

刘慧春 周江华 张加强 许雯婷 朱开元

(浙江省园林植物与花卉研究所，浙江 杭州 311251)

油用牡丹是原产于我国的一种优良木本油料植物，其中凤丹是江南地区油用牡丹的主栽品种，耐干旱、瘠薄、盐碱，抗寒能力强，适应范围广。2011年，牡丹籽油被国家卫生部批准为新资源食品，进入食用油行列，其不饱和脂肪酸含量较高(83.05%～90.00%)，尤其是亚麻酸占不饱和脂肪酸含量高达31.56%～66.85%[1-2]，远高于目前市场上销售的主要食用油。对油用牡丹的含油量进行评价是发展油用牡丹产业的一项重要工作，而单粒选种是油料作物育种的重要环节，特别是对于育种资源有限的子代，因此建立无损检测方法尤为重要。用传统的化学方法测定含油量不仅需要破坏种子，而且过程十分繁琐，需要经过去皮、粉碎、萃取等一系列操作流程，耗时且耗材[3]。近红外光谱分析技术(near infrared reflectance spectroscopy, NIRS)是1980年代后期发展起来的一种高效、快速、低成本、无损伤的现代测试技术[4-6]，该方法已被广泛应用于玉米(Zeamays)[7]、油菜(Brasscicacampestris)[8-11]、橄榄(Canariumalbum)[12]、羽衣甘蓝(Brassicaoleraceavar.acephala)[13]、水稻(Oryzasativa)[14]及其他油料作物[15-18]的含油量、油料品质等各项油料指标的测定。崔虎亮[19]首次采用NIRS技术测定紫斑牡丹种子主要脂肪酸成分，取得了较好的效果，但种子含油量建模效果不佳，主要原因可能是未找到适合的光谱采集适配器。因此油用牡丹种子含油量的无损检测方法有待继续研究和完善，同时关于油用牡丹凤丹种子含油量NIRS数学模型的构建迄今鲜有报道。

本研究利用近红外光谱扫描技术，获得油用牡丹凤丹种子的光谱数据，结合传统的化学测定结果，建立NIRS技术定量分析凤丹种子单粒含油量的数学模型，旨在为油用牡丹种子高含油量品种的育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油用牡丹种子样品分别采集自浙江省园林植物与花卉研究所牡丹基地(临浦)、浙江省金华市浦江县檀溪镇大元村油用牡丹基地、浙江省金华市磐安县大盘镇下寮村油用牡丹示范基地，采集样品数量分别为100(临浦)、50(浦江)、50份(磐安)，为江南油用牡丹隔离种植的不同株系。

1.2 仪器与试剂

恒温烘箱(上海精宏实验设备有限公司，DHG-9023A)、 定性滤纸(杭州富阳北木浆纸有限公司，直径9 cm 中速)、干燥器(江苏华鸥玻璃有限公司，240#，含硅胶BS-2101)、研钵(洛阳伊耐陶瓷科技有限公司，130 mm)、分析天平[梅特勒托利多科技(中国)有限公司，上海，AB204N]、实验用粉碎机(上海净信实业发展有限公司，JXFSTPRP-48)、电热恒温水浴锅(常州越新仪器制造有限公司，HH-4)、近红外光谱仪(ThermoFisher Scientific，美国，Antaris Ⅱ)、索氏抽提器(杭州菲跃仪器有限公司，FY-SXT-04)、气相色谱仪(ThermoFisher Scientific, 美国，TRACE 1300)。

石油醚(30～60℃)(常州市中超化工有限公司，分析纯)、甲醇(苏州嘉鼎化学科技有限公司，分析纯)、氢氧化钾(常州市启迪化工有限公司，分析纯)。

1.3 试验方法

1.3.1 含油量的化学测定方法 化学测定法采用索氏抽提法，按《GB/T 5009.3-3006食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[20]进行测定。选取成熟度、饱满度一致的牡丹种子4粒，用实验用粉碎机将其磨碎，放入叠好且烘干至恒重的滤纸袋(m1)中，于恒温烘箱中烘干，直至种子重量不再变化，放于干燥器中待其冷却至室温，称重(m2)。含料滤纸袋堆叠整齐，置入索氏抽提器的抽提筒中，在抽提筒中加入石油醚，直至没过滤纸袋。控制抽提温度使提取液每8～10 min回流一次。样品抽提时间控制在20 h左右。提取结束时取1 mL提取液，用甲醇氢氧化钾脂化后上气相色谱检测，若无明显脂肪酸成分检出，即抽提完全。将抽提后的滤纸包放于通风橱吹风晾干，待纸包上的抽提液挥发完毕，再恒温干燥至恒重，将其放置于干燥器中冷却至室温，称量(m3)。每个样品做3次重复，取平均值为籽粒平均含油量。

含油量=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

为确定烘焙时间和抽提时间，首先选用样品数量比较多的PJ15和PJ16 2个品种进行条件优化试验，分别采用简单手工破碎和机械均匀粉碎的方法测定烘焙所用时间，然后用气相色谱法测定脂肪酸残余确定抽提所用时间。确定烘焙条件和抽提时间后，其余样品按优化后的条件进行测定。样品烘焙至恒重所需时间作为烘焙时间，即烘焙的样品每隔半小时称重一次，直至前后两次重量变化在0.5%以内。

1.3.2 近红外光谱数据的采集 利用近红外光谱仪，设置仪器工作参数，光谱区间扫描范围为4 000～10 000 波数(cm-1)，扫描次数为16，分辨率为8 cm-1。试验中选择与含油量分析中大小色泽等外观均匀一致的种子，采用漫反射扫描，对种子的正反面各扫描一次。利用仪器自带的软件采集光谱，利用TQ Analyst软件进行数据分析和模型构建。仪器开机前检测仪器内干燥剂为蓝色。每个样品取3粒种子正反扫描共6条光谱数据，取这6个光谱数据的平均数得到平均光谱，同时得到波长数据，保存数据后待分析。

1.3.3 NIRS数学模型的建立 分别采用偏最小二乘法(partial least squares，PLS)和主成分回归法(principal component regression， PCR)进行模型的构建。为消除背景噪声影响，使用各种光谱预处理方法优化模型，包括多元信号矫正(multi signal correction, MSC)、标准正则变换(standard normal variation, SNV)、一阶导数(1st)以及多种方法结合。模型的预测精度和稳健性采用校正相关系数r1、预测相关系数r2、校正均方根误差(root mean square error of calibration, RMSEC)和预测均方根误差(root mean square error of predication, RMSEP)进行评价[21]。

2 结果与分析

2.1 干燥烘焙时间的确定

含油量分析前首先需要去除种子的水分。由于牡丹种子的种皮和胚比较致密，胚粉碎方式与烘干至恒重所需时间密切相关。本研究采用2种粉碎方式手动破碎(锤子敲破)和粉碎机均匀粉碎，结果如图1所示。手动破碎需要105℃烘焙10 h以上，品种PJ15和品种PJ16烘干至10 h时与烘干8 h相比，仍然有明显的重量变化，分别降低1.80%和1.69%，尚未达到烘干至恒重的国家标准。PJ15和PJ16采用粉碎机粉碎(PJ15C和PJ16C)，烘干2 h的重量比烘干1.5 h分别降低0.04%和0.07%，重量变化已达到恒重的国家标准《GB 5009.3-2006食品安全国家标准 食品中水分的测定》[22]。说明粉碎机均匀粉碎只需要1 h烘焙即可到达恒重。为保证不同品种牡丹种子均能被完全烘干，本试验延长1 h烘焙时间，据此确定粉碎机粉碎后105℃烘焙2 h为牡丹籽烘干条件。

2.2 牡丹籽抽提时间的确定

为了确定索氏抽提器中回流抽提的时间，比较回流液中1和18 h气相色谱分析获得的脂肪酸峰面积(图2)。1 h时的峰面积为86.58，18 h时峰面积为2.54，空白溶剂的峰面积为2.33，18 h回流液已经与空白溶解的峰面积相当，因此认为抽提已完成。即抽提18 h以上可以达到抽提完全的效果，试验中选用抽提20 h。

注：PJ15和PJ16表示2个牡丹籽品种采用锤子敲破的方法手工破碎，PJ15C和PJ16C表示这2个品种采用粉碎机均匀粉碎。Note: The hammer was used to break the peony seeds of PJ15 and PJ16, and PJ15C and PJ16C were uniformly crushed by the pulverizer.图1 牡丹种子重量随烘焙时间变化曲线Fig.1 Variation curve of peony seed weight with baking time

图2 抽提1和18 h回流液中脂肪酸成分气相色谱峰面积比较Fig.2 Comparison of gas chromatographic peak areas of fatty acids in refluxes extracted for 1 and 18 h

2.3 油用牡丹种子含油量的分布

将上述破碎烘干处理后的200份样品经化学方法测定，得到牡丹种子含油量的样品次数分布图(图3)。结果表明，样品分布次数属于正态分布类型。含油量在10%～28%之间，大部分样品的含油量集中在18%～24%之间，极少数分布在10%～12%和26%～28%这两个范围，没有低于10%或高于28%的样品。

采用化学方法测得的数据显示，本试验采集的样品基本覆盖了油用牡丹凤丹种子含油量的变化范围，具有较好的代表性。

图3 化学方法测定单粒含油量的分布图Fig.3 Distribution map of single oil content determined by chemical method

2.4 NIRS数学模型的建立

2.4.1 油用牡丹种子单粒含油量NIRS模型的建立及内部交叉检验 NIRS数学模型的建立是采用近红外检测仪将样品的光谱扫描数据和化学方法测定结果进行比较，主要采用内部交叉检验法和外部检验法。内部交叉检验以检验的相关系数为参考，相关系数越接近1可靠性越高。模型的构建采用PLS和PCR两种方法，由表1可知，采用PLS模型，标准曲线校正相关系数在0.726 8～0.980 1之间；采用PCR模型，校正相关系数在0.726 6～0.948 4之间，因此PLS模型比PCR模型更适用。光谱数据采用一阶导数处理时，标准曲线校正相关系数在0.970 3～0.980 1之间；采用二阶导数处理时，校正相关系数在0.756 2～0.974 8之间，揭示光谱数据采用一阶导数处理比二阶导数处理更好。光谱数据采用Norris平滑，标准曲线相关系数最高可到0.980 1；而采用Savitzky-Golay平滑，最高相关系数为0.978 5，可见Norris平滑比Savitzky-Golay平滑更适用。光程采用固定或随机，相关系数无差异，因此光程参数对数据分析的影响不大。

比较不同模型和参数后，确定模型建立最佳参数为：采用最小偏二乘法(PLS)，光程固定，一阶导数消除背景，数据平滑处理采用Norris derivative filter的方法，平滑参数选用5和3(平滑参数选用5和2能得到相同效果，但5和3为系统默认的平滑参数)。模型的预测精度和稳健性采用校正相关系数r1、预测相关系数r2、校正均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)这4个参数分别为0.980 1、0.957 6、0.463和0.705，均为参数优化后的最优值。其中校正相关系数是首要决定参数，揭示标准样品和光谱曲线的相关性，越接近1表示相关性越好，光谱预测样品的准确性越高。

图4显示了牡丹籽单粒含油量最佳近红外预测模型，可以看出，多数样品都沿标准曲线分布，离散点较少，校正相关系数0.980 1，预测相关系数0.957 6(图4-A)。图4-B显示了每个样品预测值和实际值的偏差，可见多数样品的含油量预测偏差在±1%以内，少数偏差在1～2%之间。含油量预测偏差在±1%以内，在品种高通量筛选中具有很好的应用价值，为F2代高世代单粒选种提供了快捷有效的方法。由此可见，内部检验的预测值与化学测定值的吻合性较好，说明该模型预测结果较为准确，也说明化学测定结果的准确度较高。

表1 油用牡丹种子单粒含油量的NIRS模型参数Table 1 NIRS model parameters of oil content in single seed of oil peony

2.4.2 NIRS模型的外部检验 随机抽取其中52份样品，采用图4的模型进行外部检验，NIRS预测值与化学方法测定值比较结果见表2。数据显示，化学法测定得到的含油量最大值为23.94%，预测含油量最大值为23.74%；化学法得到的含油量平均值为20.48%，预测平均值为20.46%，两者的拟合性均较好，预测值和测定值相关系数达0.957 6，平均误差小于3%。由此说明，本试验所构建的牡丹种子单粒含油量的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹种子的单粒含油量。

3 讨论

与传统的化学方法相比，近红外测试方法表现出明显的优势，如简便、迅捷、无污染，特别对测试样品无损伤，有助于单粒选种，在一定程度上解决了杂交低世代品质育种的测样问题，对于育种资源有限的种子后代非常重要。此外，建立准确的数学模型，对于样品的分析和筛选至关重要。对于初次建模的样品，需要参考化学测定结果，所以化学测定值的准确性直接影响NIRS模型的精确度和使用效果[23]。油用牡丹种子比油菜、大豆等油料种子大，且外种皮偏硬。据文献报道，去除种皮可以提高NIRS建模效果[24-27]。但去除种皮费工费时，因此本研究对索氏抽提法进行了改进，省略单粒去皮步骤，利用粉碎机将油用牡丹种子进行充分粉碎，并烘干水分后再进行抽提，测得的单粒含油量化学值与NIRS预测值拟合度较高(0.980 1)， 说明本研究改进的索氏抽提法可行。另外，在保证样品具有代表性、化学值准确的基础上，选择最佳的NIRS数学模型参数也很关键[27]。本研究结果表明，采用PLS模型，光谱数据采用一阶导数，平滑方式选用Norris derivative filter的方法，平滑参数选用5和3，用这一套参数构建的油用牡丹单粒含油量NIRS模型效果最佳。

表2 化学法与NIRS预测值数据表Table 2 Chemical method and NIRS prediction data sheet

图4 牡丹籽含油量近红外预测模型Fig.4 Near infrared model of oil content of peony

本研究所选用的测试样品涵盖了整个江南地区的油用牡丹种质资源，取材范围较广，具有较好的代表性。按《GB/T 5009.3-2016食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[20]，运用化学测定法测定样品单粒种子的含油量，并建立相应的NIRS数学模型，再用该模型获得的预测值与化学方法获得的测定值进行比较，其内部交叉检验相关系数和外部检验相关系数都高于0.9，校正均方根误差和预测均方根误差均小于1。说明本研究建立的单粒NIRS模型精确度很高，所构建的模型具有较好的预测能力，能够代替常规且繁琐的化学测试法，快速、准确且无损伤地预测油用牡丹单粒种子的含油量，对高含油量的优良种质资源筛选具有重大意义。但由于模型具有较强的地域性，如果所分析的样品超出了建模时的标样范围，需在模型中加入该样品的标样，否则其模型的准确度会难以保证[28-31]。因此，本研究构建的油用牡丹单粒种子含油量NIRS模型仅适用于江南地区，其他地区若使用该模型，需在该模型中加入其对应地区的标样，以提高NIRS模型的精确度[32]。后续有望继续扩大取样范围，增加样品数量，以提高NIRS模型的使用范围和检测效果。并进一步开展油用牡丹凤丹籽油品质方面的指标检测，建立油酸、亚麻酸、亚油酸等脂肪酸及蛋白质成分的NIRS数学模型。

4 结论

本研究采用索氏抽提法测试了200份油用牡丹单粒种子的含油量，并应用近红外反射光谱(NIRS)技术采集了样本的光谱数据，通过偏最小二乘法(PLS)构建了油用牡丹种子单粒含油量的NIRS数学模型。化学法测出的籽油含量变化范围在10%～28%之间，其分布图基本符合正态分布。构建的数学模型经内部交叉检验和外部检验，相关系数均在0.9以上，说明本试验所构建的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹单粒种子的含油量。