水稻淡黄叶突变体xws的光合特性与基因定位

刘 芬 陈桂华 王 悦 唐文帮,*

(1 湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2 怀化职业技术学院，湖南 怀化 418000)

水稻(OryzasativaL.)植株中90%～95%的干物质来自光合作用[1]。叶绿体是植物光合作用的重要场所，叶绿素是植物吸收和传递光能的主要载体，因此，叶绿体发育情况和叶绿素含量会直接影响植物光合能力[2-3]。叶色发生突变大部分是受叶绿体发育和叶绿素含量异常的影响，因此利用叶色突变体可以定位并克隆与水稻光合作用相关的新基因，对培育高光效和高产水稻具有重要的理论意义。

近年来，叶色突变体已被应用于植物光合作用和光形态机制[4]、叶绿体的结构和发育机理[5]、叶绿素的代谢和合成途径[6-7]、形态标记性状和特殊种质[8-9]等基础研究。胡彬华等[10]通过60Co-γ射线辐射川恢907，从辐射后代中筛选到一个淡黄叶突变体pyl3，该突变体整个生育期呈淡黄叶表型；与野生型相比，pyl3的叶绿素含量和农艺性状指标均显著降低；通过基因定位将该基因初步定位于第3号染色体上InDel标记M4和M6之间。林添资等[11]从早熟晚粳稻中发现一个黄绿叶自然突变体ygl14(t)，该突变体整个生育期表现呈黄绿叶；与野生型相比，ygl14(t)的农艺性状指标和色素含量显著降低，叶绿体发育异常；利用ygl14(t)与9311的F2群体，将该基因定位于第11号染色体短臂上的标记D-6和W1之间。张天泉等[12]采用甲基磺酸乙酸(ethyl methane sulfanate, EMS)诱变处理缙恢10号，从中获得突变体ygl9，在苗期叶色呈现黄绿色，抽穗期渐变为淡绿色；与野生型相比，ygl9的光合色素降低，叶绿体嗜锇小体明显增多；构建西农1A与ygl9的F2群体，将突变基因定位在第3号染色体短臂标记SSRS03-1和Ind03-19之间。孙小秋等[13]通过EMA诱变获得一个水稻黄绿叶突变体ygl98，叶色呈黄绿色；与野生型相比，ygl98的株高变矮小，有效穗数和结实率下降，叶绿体形状不规则，类囊体数目减少；利用ygl98/浙辐802的F2作为定位群体，将突变基因定位在第3号染色体长臂InDel标记I3和I4之间。陈盛杰等[14]从龙特甫B转基因后代中获得一个淡黄叶突变体体ygl-11，整个生育期表型保持淡黄叶；与野生型相比，光合色素显著降低，利用T-DNA 标签的方法，从突变体中克隆到OsGUN4基因位于水稻第11染色体上。Wu等[15]从籼稻品种中分离出水稻黄绿叶突变体ygl1，在前期叶片表现出黄色，中期逐渐转绿；与野生型相比，ygl1叶绿素含量下降；进一步将ygl1基因定位在第5号染色体上，并通过图位克隆发现该基因属于编码叶绿素合成酶，催化叶绿素a的形成。Zhang等[16]研究黄绿化突变体chl1和chl9，叶片呈浅黄绿色，叶绿素减少，叶绿体发育不全；进一步利用定位群体将chl1和chl9基因定位在第3号染色体上；图位克隆发现，chl1和chl9基因编码ChlD和ChlI亚基镁螯合酶，参与叶绿素合成的关键酶。

目前，与水稻叶色相关的基因较多，已被克隆的有80多个，但叶色变异的过程和调控光合的机制尚不明确。因此仍需探究新的突变体，挖掘更多叶色突变基因，以解析水稻高光效育种中光合作用的机理。鉴于此，本研究在不育系选育群体中发现一株自然变异的淡黄叶突变体，命名为xws，对该突变体进行表型鉴定和光合特征研究，并对其进行精细定位和候选基因分析,旨在探索叶色突变体的突变机理，为提高水稻光合作用和降低杂交水稻种子生产成本提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料野生型(wildtype，WT)为P88S，淡黄叶突变体为xws，由湖南农业大学水稻研究所提供。种植于湖南农业大学校耘园和海南三亚科研基地，按当地常规水肥条件进行田间种植管理。

1.2 光合色素含量测定

在苗期和抽穗期各选取3株水稻叶片，苗期选取三叶期叶片，抽穗期选取剑叶，以及苗期的茎和抽穗期的穗，分别将叶片、茎和穗剪成2～3 mm的细丝状。分别称取0.1～0.2 g剪碎的叶片浸泡于含10 mL 95%无水乙醇的管中，放置于4℃冰箱中暗处理，至样品完全发白(一般放置时间为48 h)；采用UV-1700型紫外可见光光度计(SHIMADZU，日本)分别在470、649和665 nm波长下测定提取液OD值，重复测量3次，测量时先用95%乙醇溶液调零。计算公式如下：

Chla=[(13.95OD665-6.88OD649)×V]/(M×1 000)

(1)

Chlb=[(24.96OD649-7.32OD665)×V]/(M×1 000)

(2)

Chl=[(18.08OD649+6.63D665) ×V]/(M×1 000)

(3)

Car=[(1 000OD470-0.5Chla-114.8Chlb)×V]/(250×M×1 000)

(4)

式中，Chla为叶绿素a；Chlb为叶绿素b；Chl为总叶绿素；Car为类胡萝卜素；V为叶绿素提取液总体积，mL；M为材料鲜重，g。

1.3 叶绿体超微结构观察

分别于苗期取突变体xws和野生型相同部位的叶片，以戊二醛和锇酸双重固定后，利用50%、70%、80%、95%和100%的丙酮逐级脱水，再进行置换和包埋，制成超薄切片，经过醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色5～10 min，用JEM-1230透射电镜(日本JEOL公司)观察野生型和突变体叶绿体的结构并拍照。

1.4 光合参数测定

选择天气晴朗的上午9：00-10:00进行光合指标的测定，选取孕穗期和抽穗期野生型和xws长势一致的植株各3株，利用Li-6400便携式光合测定仪(北京易科泰生态技术有限公司)测定野生型和xws的剑叶的光合指标，包括叶片蒸腾速率(transpiration rate, Tr)、净光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、气孔导度(stomatal conductance, Gs)和胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration, Ci)，每次测量重复3次，取平均值。

1.5 叶绿素荧光参数测定

采用FluorPen FP 100-MAX便携式叶绿素荧光仪(北京易科泰生态技术有限公司)，在孕穗期和抽穗期选取水稻主茎倒二叶叶片中部，测定相关叶绿素荧光参数，突变体和野生型各测定3次。测定前将叶片暗适应20 min，设置饱和脉冲约3 000 μmol·m-2·s-1，光化光1 200 μmol·m-2·s-1，通过测叶绿素荧光动力学曲线，获得初始荧光(original flcorescence,Fo)、PSⅡ最大光化学量子产量(maximum photochemical,Fv/Fm)、光化学淬灭系数(photochemical quenching, qP)和非光化学淬灭系数(non-photocherial quenching, NPQ)等叶绿素荧光参数。根据公式计算电子传递速率(ono-photochenial quenching, ETR)：

ETR=PAR×(ΔF/Fm′)×0.84×0.5

(5)

式中，PAR为光合有效辐射(photosythetic active radiation)；ΔF/Fm′为PSⅡ实际光化学量子产量(actual photochemical efficiency of PSⅡ in the light)。

1.6 基因的精细定位及候选基因预测

利用集团分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)筛选目标基因连锁标记，挑选出10株正常表型株和10株突变体表型株分别构建基因池，用均匀覆盖于水稻12条染色体上的简单重复序列 (simple sequence repeats，SSR)标记，进行亲本间的多态性筛选，用筛选到的多态性标记进行基因的初步定位，确定与目的基因初步连锁的SSR标记。为了进一步精细定位目的基因的位置，以突变体xws和恢复系R032杂交构建的F2群体作为基因定位群体。从xws/R032的定位群体F2中选取698份淡黄叶单株，并加密标记，采用步移法逐渐缩小定位区间。选取亲本及F2群体中突变体植株约4 cm的叶片，放入2.0 mL的离心管中，采用CTAB法提取水稻DNA。PCR反应体系共10 μL：20 ng·μL-1DNA模版1 μL，20 mol·μL-1引物1 μL，10× Buffer 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTPS 0.2 μL， 5 U·μ-1Taq 0.1 μL, ddH2O 6.7 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55～58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终延伸7 min，PCR产物于4℃冰箱保存备用。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。利用水稻基因注释数据库，查看定位区段内开放可读框(open reading frame，ORF)的信息，对基因进行预测，得到叶绿素或叶绿体相关的基因。

2 结果与分析

2.1 突变体xws的表型特征

由图1可知，与野生型相比，苗期突变体xws的茎和叶表现出明显的黄色表型，随着生育进程推进，分蘖期和抽穗期的叶片和叶鞘以及抽穗期的穗部表型均为淡黄色。由此可知，突变体xws在整个生长周期均表现为淡黄色。

注：A：野生型和突变体xws在苗期的表型；B：野生型和突变体xws在分蘖期的表型；C：野生型和突变体xws在抽穗期的表型；D：野生型和突变体xws抽穗期的穗部表型。Note: A: Phenotype of wild type and mutant xws at seedling stage. B: Phenotype of wild type and mutant xws at tillering stage. C: Phenotype of wild type and mutant xws at heading stage. D: Panicle phenotype of wild-type and mutant xws at the heading stage.图1 突变体xws的植株表型Fig.1 Plant phenotypes of mutant xws

2.2 突变体的光合色素含量

突变体xws的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素在苗期和抽穗期的变化规律一致(图2)。在苗期，突变体xws叶片中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素相比野生型分别减少48.3%、72.9%、45.3%和45.8%；茎中分别减少42.3%、52.7%、41.3%和44.9%。在抽穗期，突变体xws剑叶的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素相比野生型分别减少50.1%、72.8%、49.9%、56.2%；穗中分别减少27.7%、39.1%、27.5%、30.9%。突变体xws与野生型的叶绿素a/b，在整个生育期内均有显著差异。突变体xws在苗期和抽穗期的光合色素含量均极显著低于野生型，推测该突变体表型变化与光合色素合成受阻有关。

注：*，**分别表示野生型与突变体在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。下同。Note: *, ** represent significant difference between wild type and the mutant at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as following.图2 突变体xws的光合色素含量Fig.2 Photosynthetic pigment content of mutant xws

2.3 突变体叶绿体的超微结构

在苗期对野生型和突变体xws的叶片进行叶绿体超微结构观察(图3)。结果表明，野生型的叶绿体形状较为规则，嗜锇小体数目多，基粒片层排列较厚，类囊体膜明显，细胞结构发育正常。突变体xws的叶绿体形状无规则，嗜锇小体消失，类囊体数量减少，基粒片层变薄。由此推测，突变体呈现出淡黄叶表型与叶绿体的发育受到阻碍有关。

2.4 突变体光合特征分析

由图4可知，与野生型相比，突变体xws的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均有所减弱。孕穗期，突变体xws的光合特性与野生型相比，均达到极显著差异，分别下降了6.7%、16.9%、5.1%和8.8%；抽穗期，突变体xws与野生型相比，净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均达到显著差异，但胞间CO2浓度差异不显著。由此可知，叶色突变导致叶片的光合功能受到损伤。

2.5 叶绿素荧光动力学参数

为了探讨突变体xws因叶色变异导致光合系统Ⅱ发生的变化，对野生型和突变体xws在不同时期叶片的荧光动力学参数进行测定(表1)。结果表明，在整个生长周期中，突变体xws的Fo均低于野生型，分蘖期和孕穗期差异达到显著或极显著水平，分别降低44.5%和17.6%，抽穗期差异不显著。xws在不同时期的最大荧光(maximum photochemical,Fm)均比野生型低，并达到极显著水平。通过比较不同生长阶段中Fv/Fm值，发现突变体xws与野生型的Fv/Fm值无显著差异，且均在0.65～0.85之间，说明突变体xws的光化学效率未受到叶色变异的影响。突变体xws的NPQ在分蘖期下降，且与野生型有显著差异，qP和ETR与野生型在3个阶段均无显著差异。

2.6 精细定位及候选基因预测

试验利用隐性群体分离法，将该突变基因xws初步定位于第3号染色体上。随后从F2中选取叶色表型为淡黄叶的群体，将xws基因初定位于分子标记WY146和WY126之间。在WY146和WY126之间继续开发标记进行精细定位，扩大定位群体，筛选到6对多态性引物(表2)，最终将xws基因定位于WY242和WY119之间，物理距离为51.7 kb(图5)，在此区间内预测到12个开放阅读框，其功能见表3。

注：A～C：野生型的叶绿体结构；D～F：突变体xws的叶绿体结构；CM：细胞膜；OG：嗜锇小体；TM：类囊体膜。Note: A～C: Chloroplast structure of WT. D～F: Chloroplast structure of mutant xws. CM: Cell membrane. OG: Osmiophilic plastoglobuli. TM: Thylakoid membrane.图3 突变体xws的叶绿体超显微结构Fig.3 Chloroplast ultramicrostructure of mutant xws

图4 突变体xws与野生型不同时期的光合特性Fig.4 Photosynthetic characteristics of mutant xws and wild type in different periods

表1 突变体xws不同时期的荧光动力学参数Table 1 Fluorescence kinetic parameters of mutant xws in different periods

注：A：利用725个F2分离单株将xws定位在分子标记RM5801与RM3346之间；B：利用486个F2分离单株，开发新标记后将xws定位于WY146和WY126之间；C：利用F2群体将xws精细定位与WY242和WY119之间51.7 kb内；D：该候选基因在物理图谱上位于BAC克隆号的区域范围；E：候选区段的物理距离为51.7 kb。分子标记之 间的数字所用单位为cM。Note: A: xws was located between molecular markers RM5801 and RM3346 using 725 F2 isolates. B: 486 F2 were used to isolate individual plants, and xws was positioned between WY146 and WY126 after developing new markers. C: Using the F2 population to fine map xws to within 51.7 kb between WY242 and WY119. D: The candidate gene is located in the region of the BAC clone number on the physical map. E: The candidate gene has a physical distance of 51.7 kb. The number between the molecular markers is in cM.图5 突变体xws基因的精细定位Fig.5 Fine mapping of mutant xws

3 讨论

水稻叶色突变体的类型较多，主要类型有白化、黄化、条纹、条斑、转绿、常绿和温敏性变色等，其中以黄化类型居多[17]。前人研究发现，yss1水稻突变体在幼苗期叶片呈条纹状，生长至后期叶色逐渐与野生型一致[18]。yl-1突变体在整个生长发育期间叶片呈黄色，且叶绿素含量显著下降[19]。本研究中，xws突变体在整个生育期叶片均呈现淡黄色，突变体苗期和抽穗期的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素与野生型相比均显著降低，推测叶绿素含量受阻可直接导致叶色呈淡黄色。

表2 xws基因的连锁标记Table 2 Sequence of markers linked with xws

表3 xws候选基因预测分析Table 3 Prediction and analysis of xws candidate genes

植株中光合色素含量的减少会直接或间接导致光合速率下降，且PSⅡ反应中心的光捕获能力较弱，光化学转化效率降低，最终使光合能力降低[20]。本研究中，突变体xws的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度均降低，这与Zhu等[17]和Wang等[21]关于ygl8和m167突变体的研究结果相似，说明叶绿素含量下降会导致光合速率减弱。在整个生长周期中，突变体xws的Fo均低于野生型，说明xws与叶色和光合色素含量的变化相同，与曹莉等[22]的研究结果一致。Fv/Fm是最大光化学量子产量，能反映PSⅡ光化学效率，一般正常生长条件下，植株叶片的Fv/Fm值在0.80～0.85之间[23-24]。突变体xws的Fv/Fm值在0.65～0.85之间，说明突变体xws的光化学效率受到叶色变异的影响。NPQ和qP反映植物热耗散能力和光保护能力[25]。在分蘖期，突变体xws的NPQ相比野生型显著下降，生长后期无明显差异，说明生长前期的光能转化效率和热耗散能力下降，这与肖华贵等[26]的研究结果基本一致。

迄今为止，在水稻中已经被发现的叶色突变体材料超过90份，其中被定位到染色体上的叶色相关基因超过145个，且均匀分布于水稻12条染色体上，其中以第3号染色体上最多[27-28]。ygl3突变体在整个生长周期内表现为黄色，该基因被定位于第3号染色体上分子标记SWU3-1和SWU3-2之间[29]；pyl-v突变体的叶片在全生育期呈淡黄叶，该基因被定位于第3号染色体上分子标记R3M1和STS3-1之间[30]。本研究中，xws基因被定位在第3号染色体上WY242和WY119标记之间，通过分析日本晴的基因组序列，发现定位区间内有4个叶色相关的候选基因：Os03g0684400编码Mg2+转运蛋白基因、Os03g0685000编码铁氧还蛋白基因、Os03g0685100编码tRNA/rRNA甲基转移酶蛋白基因、Os03g0685300编码谷氨酰胺转酰胺酶Ⅰ类结构域蛋白基因。其中Os03g0685000被证实是一个叶色突变基因，被命名为OsFdC2，其编码区第1 447位碱基由C替换为T，导致编码蛋白改变，从而造成叶绿体发育延缓，叶绿素含量降低，整个生育期叶色呈黄绿，并且生长速率缓慢、抽穗晚，同时，还发现其株高、单株穗数和每穗粒数相比野生型显著降低[31]。但本研究中，突变体xws整个生育期的叶片、茎和穗都呈淡黄色，株高、单株有效穗数和穗粒数均比野生型有所增加[32]，这与OsFdC2的相关表型不一致。因此，本研究后续将进一步对候选基因进行克隆和功能分析，以期为解析其突变机制奠定基础。

4 结论

本研究发现，与野生型相比，突变体xws叶绿素含量显著降低，叶绿体形状无规则，光合能力减弱，表明该突变体的淡黄色表型与光合色素含量下降、叶绿体发育受阻和光合系统受损有关。xws基因定位于第3号染色体上分子标记WY242和WY119之间，物理距离为51.7 kb。