lncRNA-MALAT1基于p-PI3K/p-AKT通路对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响

于江龙 阿不都拉·艾沙 杨 岩 克热木·阿卜力提普 栾新平

胶质瘤细胞是人中枢神经系统中发病率最高且致死率最高的一种原发性恶性肿瘤，具有恶性程度高、增殖速度快、肿瘤异质性明显的特点，这些特点都是导致该病对放疗、化疗具有极高耐受性的原因[1-2]，而p-PI3K/p-AKT信号通路是与胶质瘤的发生具有密切联系的信号通路，可调控胶质瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等多种恶性生物学行为，在脑胶质瘤的治疗中发挥重要作用[3-4]。lncRNA是一类非编码RNA，具有高度保守的序列和表达的时空特异性以及特定的空间二级结构，通过下调其表达可以改变胶质瘤细胞的生物学行为[5]。有研究表明[6]，lncRNA-MALAT1在多种恶性肿瘤中均异常表达，可通过相关的信号通路发挥致癌基因的作用。本文旨在研究lncRNA-MALAT1基于p-PI3K/p-AKT通路对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

研究细胞：人脑胶质瘤细胞株U87购自中国科学院上海细胞库。

主要试剂及材料：牛血清(郑州九龙生物制品)，DMEM培养基(上海一基实业有限公司)，恒温箱(深圳市北特仪器设备有限公司)，嘌呤霉素(湖北正兴源精细化工有限公司)，EDTA-K2抗凝管(深圳市保安医疗用品有限公司)，胰酶(西安拉维亚生物科技有限公司)，酶标仪(济南骏驰生物科技有限公司)，酶标仪(四川翼高科技有限公司)；TBST溶液(上海图赫实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的U87细胞从液氮中取出，放置37℃水浴，快速解冻，解冻完成后，使用75%乙醇擦拭冻存管外部避免污染，在细胞超净工作台将U87细胞加入1.5 ml DMEM培养基，用移液枪头反复吹吸，将细胞团分散混匀，转入离心管离心5 min，转速为1000 r/min，弃去上清液，加入培养基，再次吹打混匀，转移到培养瓶，静置于37℃，5%CO2的恒温箱，2～3天更换一次培养基，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 细胞转染与分组 将培养的对数期生长的U87脑胶质瘤细胞株接种在12孔板中，当密度达到50%时进行转染，分为脑胶质瘤组、空白组和转染组。脑胶质瘤组不做处理，空白组为无意义序列，转染组加入lncRNA-MALAT1慢病毒(lncRNA-MALAT1序列：5'-TGGCACCACACCTTCTACAA-3')。转染组转染时将细胞与含有病毒的上清液同时进行孵育，48 h以后加入嘌呤霉素进行抗筛选，两天更换一次清洗液，2周后转染的细胞宣布死亡，再将嘌呤霉素的浓度改为2 μg/ml，然后将细胞转入培养瓶中进行培养。

1.2.3 lncRNA-MALAT1表达检测 将细胞碾碎，利用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，使用微量分光光度计测量RNA的浓度，使用逆转录试剂盒将RNA转录呈cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒进行检测，PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循环40次，利用2-△△Ct计算lncRNA-MALAT1表达量。

1.2.4 细胞凋亡情况 流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞凋亡的情况，取出六孔板，37℃ PBS洗涤贴壁细胞2次并收集，滴加适量0.25%胰酶消化细胞，待细胞刚脱落时，吸弃胰酶，需避免胰酶的过度消化，用含2%BSA的PBS(4℃)终止消化。吹打混匀后将细胞收集到离心管内，1 ml PBS(4℃)重悬转入1.5 ml的EP管中，2000 rpm，4℃离心5 min，吸弃上清，重复上述步骤：重悬，离心，弃上清后，加入500 μl Binding Buffer，吹打悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC轻轻混匀，4℃避光孵育30 min，往EP管中加入5 μl PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育5～15 min，用300目铜网过滤，在1 h内使用流式细胞仪检测。

1.2.5 MTT检测细胞增殖情况 将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化后，充分吹打成单细胞悬液，计数后以2.5×104个/孔接种于96孔培养板中培养，当细胞密度达到70%时，弃去大部分培养液，加入适当培养基，26 h后，用枪头吸去培养液，小心用PBS洗2遍，每孔加入终浓度为0.5 mg/ml MTT的新鲜培养液100 μl，继续培养4 h，吸弃MTT溶液，每孔加入100 μl DMSO后，将培养板置于振荡器上振摇10 min，使形成的紫色结晶充分溶解，多功能酶标仪570 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.6 Transwell检测细胞侵袭 将基质胶在4℃的冰上解冻过夜，再用EP管预冷，用PBS洗涤3次，在37℃，5%的CO2培养箱内培养4 h，用胰酶消化细胞，无血清培养基洗涤细胞，在显微镜下记录细胞的数量，用结晶紫进行染色，再用PBS洗涤3次，用浓度为95%的乙醇固定35 min，再用显微镜观察穿膜细胞的数量。

1.2.7 Western blot法检测相关蛋白水平 U87脑胶质瘤细胞培养至80%的汇合率时，进行Western blot法检测p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白以及MMP2、MMP9蛋白水平，先用冷PBS清洗细胞，加入配好的细胞裂解液，4℃下裂解5 min，用细胞刮子刮下细胞，将其吸入到EP管中，15000 r/min，离心20 min，吸取的上清液即为所需全蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，煮蛋白98℃ 5 min，将取样蛋白样进行电泳，转膜，用TBST配制的牛奶封闭1 h，加入一抗在4℃下孵育过夜(p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白以及MMP2、MMP9按照1∶1000的比例进行稀释)，过夜后用TBST洗膜5次，每次6 min，然后用荧光二抗避光孵育1 h，扫描灰度并计算p-PI3K/p-AKT通路蛋白以及MMP2、MMP9蛋白的表达量，GAPDH为内参蛋白。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组lncRNA-MALAT1表达量比较

与脑胶质瘤组相比，空白组、转染组lncRNA-MALAT1表达量较低；与空白组相比，转染组lncRNA-MALAT1表达量较低，lncRNA-MALAT1在脑胶质瘤组中呈高表达(P<0.05),见表1。

表1 脑胶质瘤细胞株中lncRNA-MALAT1表达量比较

2.2 各组脑胶质瘤细胞凋亡、增殖率比较

与转染组相比，空白组、脑胶质瘤组细胞凋亡率较低；与空白组相比，胶质瘤组细胞凋亡率较低。与转染组相比，空白组、脑胶质瘤组细胞增殖率较高；与空白组相比，脑胶质瘤组细胞增殖率较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组脑胶质瘤细胞凋亡、增殖率比较

2.3 各组p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白表达水平比较

与转染组相比，空白组、脑胶质瘤组p-PI3K、p-AKT蛋白表达较高；与空白组相比，脑胶质瘤组p-PI3K、p-AKT蛋白表达较高(P<0.05)，见表3、图1。

表3 各组p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白表达比较

图1 各组p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白表达水平比较

2.4 各组胶质瘤细胞侵袭状况比较

如图2所示，空白组、转染组胶质瘤细胞侵袭个数均低于脑胶质瘤组，转染组胶质瘤细胞侵袭个数低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。如表4、图3所示，与转染组相比，空白组、脑胶质瘤组MMP2、MMP9蛋白表达较高；与空白组相比，脑胶质瘤组MMP2、MMP9蛋白表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组细胞侵袭图(结晶紫染色，200×)

表4 各组侵袭相关蛋白表达比较

图3 MMP2、MMP9蛋白表达变化情况

3 讨论

脑胶质瘤是成人中常见的一种颅内肿瘤，同时也是侵袭性和致死性最高的恶性肿瘤之一，其发病是由多因素、多基因共同作用的结果，细胞增殖、凋亡、侵袭均会在多种致癌物质的诱发下失控，最后导致肿瘤的发生和发展[7-8]。目前，治疗脑胶质瘤的方法有很多，如神经导航下手术切除、放化疗、基因治疗等，但由于胶质瘤的恶性程度较高、进展速度较快，因此这些治疗方法的效果较差，脑胶质瘤患者的预后和生活质量未见改善[9-10]。

有研究表明[11]，人类基因组中有1%的基因可以转录成有编码蛋白质功能的RNA，但是大部分的RNA是无蛋白编码功能的非编码RNA，而lncRNA就是一种非编码RNA，且其异常表达与人类脑胶质瘤的发生密切相关，参与脑胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭等生物学过程。有研究指出[12]，肿瘤的发生和发展必须具备细胞持续性的增殖、抑癌基因失活、细胞永生化、侵袭、细胞凋亡抑制等基本生物学特征，而研究发现高表达的lncRNA可促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭，抑制其凋亡。MALAT1主要存在于人体细胞的核散斑中，而核散斑是一个重要的亚核结构，其中含有大量的核蛋白，这些蛋白参与前体心室RNA的交替剪接和转运，表明MALAT1是转录后RNA修饰的一个调控因子，通过基因芯片及PCR技术发现一个与胶质瘤发生相关的lncRNA-MALAT1在多种胶质瘤细胞系和胶质瘤组织中呈高表达[13]。脑胶质瘤的发病是多因素多基因作用的结果，而细胞的信号传导对这一过程起到重要作用，p-PI3K/p-AKT通路能够被一些神经营养因子和其他生物学刺激而激活[14-15]，可对细胞的增殖和凋亡造成直接影响，同时对肿瘤的生长和对化疗的反应也可造成深刻的影响，p-PI3K/p-AKT通路在细胞内可抑制凋亡，促进增殖，对肿瘤下游多种效应分子的活化状态进行影响[16-17]。本文研究显示，通过下调lncRNA-MALAT1可调控p-PI3K/p-AKT通路相关蛋白的表达，抑制脑胶质瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡。

MMPs是高度保守的一种基质金属蛋白酶，在正常人体中，MMPs的表达量极少，当人体处于病理状态中时，由于炎性细胞因子、激素以及生长因子的刺激，MMPs的表达量会急剧上升[18-19]。有研究表明[20]，MMP2、MMP9与脑胶质瘤的侵袭性密切相关，细胞的侵袭性越强，脑胶质瘤细胞分泌的MMP2、MMP9的量就越多，MMP2、MMP9可通过降解胶质瘤细胞外基质，而为肿瘤向正常组织侵袭提供通路和空间，进而对脑胶质瘤的侵袭性生长产生影响。本文研究结果显示，lncRNA-MALAT1可通过抑制p-PI3K/p-AKT信号通路相关蛋白的表达而降低MMP2、MMP9蛋白的表达量，抑制胶质瘤细胞的侵袭。研究显示[21]，lncRNA-MALAT1可通过抑制p-PI3K/p-AKT信号通路而抑制MMPs蛋白的活性，继而抑制脑胶质瘤细胞的侵袭性，与本文研究结果一致。

综上所述，lncRNA-MALAT1可有效降低p-PI3K/p-AKT信号通路相关蛋白的表达，继而有效抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭，促进胶质瘤细胞的凋亡，降低MMP2、MMP9蛋白的表达量。