间变性大细胞淋巴瘤激酶蛋白在儿童外周神经母细胞性肿瘤中的表达及意义

陈 干 樊金星 黄 慧 徐 锦 杨文萍 陶 强

外周神经母细胞性肿瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)是儿童常见的颅外实体瘤，其异质性强，从自发性消退、分化成熟到转移死亡，在不同年龄、不同临床分期的病例间预后差异较大[1]。国际神经母细胞瘤危险因素分组(International Neuroblastoma Risk Group，INRG)中的年龄、临床分期、组织学类型、肿瘤细胞的分化程度、N-MYC基因状态、11q及DNA指数是目前主要的预后评估参数，间变性大细胞淋巴瘤激酶蛋白(ALK)及基因异常在pNT中的意义未达成共识[2]。本实验对不同年龄段的儿童pNT进行ALK蛋白和N-MYC基因检测，探讨ALK蛋白检测的临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集江西省儿童医院病理科2010年1月至2020年6月存档的外周神经母细胞性肿瘤94例，诊断标准参考2017年发表的《外周神经母细胞性肿瘤病理诊断共识》[3]，共46例临床资料完整和诊断明确的病例纳入研究。46例pNT中男性24例,女性22例；平均年龄24个月(年龄0.3～144个月)，其中≤18个月28例(新生儿NB 15例)，>18个月18例；送检部位肾上腺12例、肾上腺外(包括颈部、纵隔、盆腹腔、骶尾部、腰部和大腿)34例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期各23例。15例新生儿NB中男孩6例、女孩9例，均为产前诊断或生后28天内在家发现包块，或因眼睑下垂、发热、呕吐、纳差及健康体检而发现包块；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ期4例。

1.2 方法

将蜡块组织做成组织芯片，连续切片进行免疫组化染色或N-MYC基因检测。所用抗体ALK(克隆号：5A4，阳性部位：胞质/胞核)购自福州迈新生物技术开发有限公司。具体操作步骤按试剂说明书进行。N-MYC基因购自广州安必平科技有限公司，判断标准参考文献[3]。应用SPSS 22.0统计软件进行分析，χ2检验或Fisher精确检验法比较临床病理参数与ALK蛋白表达的关系。

2 结果

2.1 病理形态分类及国际神经母细胞瘤病理分类

46例pNT中，神经母细胞瘤(NB)40例、节细胞性神经母细胞瘤(GNB)6例。40例NB中分化差型38例、未分化型和分化型各1例，其中预后良好型(FH型27例)、预后差型(UH型13例)。6例GNB中结节型1例(UH)，混杂型5例(均为FH)。15例新生儿NB均为分化差型，其中FH型14例、UH型1例。

2.2 免疫表型和荧光原位杂交

ALK在NB和GNB中的阳性表达率分别为55%(22/40)和0(0/6)，差异具有统计学意义(P=0.038)。40例NB中N-MYC基因扩增阳性4例、获得7例，6例GNB均无N-MYC基因扩增和获得；4例N-MYC基因扩增阳性者均表达ALK蛋白，7例N-MYC基因获得者5例表达ALK蛋白。15例新生儿NB中ALK蛋白阳性表达率为40%(6/15)(Ⅰ期和Ⅲ期各2例、Ⅱ期和Ⅳ期各1例)，100%(15/15)N-MYC基因扩增阴性。ALK蛋白在Ⅲ～Ⅳ期、UH型和N-MYC基因异常中表达率高，差异具有统计学意义(P=0.018、0.001、0.010)，在不同性别、年龄和部位间无差异表达(P=0.382、0.400、0.617)。

3 讨论

根据组织形态学外周神经母细胞性肿瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)分为神经母细胞瘤(NB)、节细胞性神经母细胞瘤(GNB)结节型和混杂型、节细胞神经瘤。在大多数家族性NB和大约10%的散发性NB中存在间变性大细胞淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因异常，包括点突变和扩增或获得[2,4]。ALK蛋白的表达与ALK基因多拷贝(包括扩增或获得)相关，但与ALK基因启动子区甲基化无明显相关性，作者同时发现ALK蛋白表达和基因异常与NB的分化状态无关[5]。根据国际神经母细胞瘤病理分类(Shimada系统)，将pNT分为预后良好型(FH型)和预后差型(UH型)。本实验发现在FH型中ALK蛋白表达率(31.25%，10/32)明显比UH型(85.71%，12/14)低，具有显著差异(P=0.001)，与文献报道一致[6]。同时本实验发现ALK在NB中的表达率比GNB高，差异具有统计学意义(P=0.038)。这些数据间接证实ALK蛋白表达与pNT预后差有关。

在NB中，ALK蛋白的表达与年龄的关系报道不一。王娟等[7]报道ALK的表达与年龄有关，年龄>1.5岁的患儿比年龄≤1.5岁患儿高(32.7% VS 6.7%)，而Chang等[6]报道与年龄无关(>1.5岁为47.2%，≤1.5岁为32%)。本实验≤1.5岁为42.9%(12/28)，>1.5岁为55.6%(10/18)，差异无统计学意义，与文献[6]报道一致。本实验发现在新生儿NB中ALK阳性表达率高达40%(6/15)，因此，ALK在不同年龄段(尤其是新生儿期)的表达意义及机制有待进一步研究。临床分期是影响NB的预后因素，进展期(Ⅲ～Ⅳ期)存在ALK高表达[6]，尤其与临床分期为III期患者预后密切相关[6]。本实验显示，Ⅲ～Ⅳ期NB患者存在更高的ALK阳性表达率(P=0.018)，3例化疗后死亡的非新生儿NB患者均为ALK蛋白阳性表达，临床分期为III期或Ⅳ期。由于可随访的数据较少，今后积累更多病例进一步研究ALK在不同临床分期中的表达意义。

文献报道[8]，ALK基因异常只是一个加速器，需要与其他基因异常共同促进NB的发生发展。Chang等[6]的研究表明，大多数ALK蛋白高表达者同时存在N-MYC蛋白高表达，而与N-MYC基因是否扩增无关，而N-MYC蛋白高表达与N-MYC基因扩增有关。本实验发现ALK蛋白在N-MYC基因异常(包括扩增和获得)中的表达率明显高于N-MYC基因扩增阴性者(P=0.010)，这是否说明除了N-MYC基因扩增外，我们也要关注一下N-MYC基因获得的病例。 根据我们的实验结果和文献报道，ALK蛋白高表达与进展期或高危NB密切相关，部分原因可能是与N-MYC基因扩增或N-MYC蛋白高表达产生的协同作用。此假设需要更大样本量前瞻性研究或细胞动物实验进行验证。对于早期或低危NB患者中ALK蛋白的表达意义及机制有待积累更多病例进行研究。