先天性晶状体脱位一家系致病基因突变筛查

倪淑华 王强 张娟美 房祥杰 赵军

原发性晶状体脱位(ectopia lentis, EL)是由睫状小带发育不良引起的晶状体异位，可以单独发生，也可以以综合征的方式发生，如马方综合征(Marfan syndrome，MFS)[1，2]。根据2010年Ghent标准，如果患者的FBN1突变曾被描述为主动脉扩张(Aortic dilatation, AO)，则患有晶状体脱位的患者可被归类为MFS[3]。无论是EL还是MFS，FBNl基因均是其主要致病基因[4]。FBNl基因位于15号染色体上，编码了320 kDa富含半胱氨酸的糖蛋白即原纤维蛋白[5]，后者是构成睫状小带的主要成分[6]。在FBNl基因中已鉴定出3000多个突变，其中不到20个与单纯的EL相关[7]。为了寻找致病基因的突变位点，我们对一山东省临沂市的EL家系进行了EL患病状况调查、全身检查和基因筛查，寻找与该家系EL发病相关的基因突变位点。研究发现，该家系所有患者均携带有FBNl基因 c.3965A>G(p.D1322G)突变，现报告如下。

资料与方法

一、患者招募和临床评估

前瞻性系列病例研究。在临沂市人民医院招募了一个来自山东省临沂市的三代汉族常染色体显性遗传的先天性晶状体脱位家庭，另选取100名健康志愿者作为正常对照。从家庭成员中收集全面的家族史和病史，特别是心脏病史、心脏彩超以及眼科检查结果，包括视力、眼压、眼轴、裂隙灯显微镜和眼底检查。根据《赫尔辛基宣言》，每个参与者都提供了知情同意书。该项目遵循赫尔辛基宣言的原则，并获得临沂人民医院医学研究伦理委员会的批准。

二、样本收集和基因组DNA提取

用涂有乙二胺四乙酸的真空管收集每个参与者的静脉血(5 ml)。通过使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，根据制造商的方案从外周血白细胞中提取受试者的基因组DNA。

三、目标基因捕获和高通量测序

应用GenCap液相捕获目标基因技术，采用全外显子检测(北京迈基诺公司)，捕获患儿所有基因的编码外显子区域和侧翼区域。利用Illumina Nextseq 500第二代测序仪捕获到的区域进行双端测序，读长为150bp。目标区域测序后，去除测序数据中的接头和低质量数据。运用BWA软件比对到参考基因组上(hg19版本)，对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计分析。

四、数据筛选和生物信息学分析

用GATK软件对这个样本的比对数据进行多态性位点的检测，对单核苷酸多态性( single nucleotidepolymorphisms，SNPs) 和插入缺失突变( InDels)等数据进行统计和分析，查找SNPs及InDels在千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及迈基诺内部1000正常汉族人群数据库频率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++ 等数据库对SNPs及InDels 的致病性进行预测分析，筛选千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及迈基诺内部1000正常汉族人群数据库中频率<0.05且预测结果均为致病性的位点作为与疾病相关的位点。

五、Sanger测序验证

根据需要测序的DNA片段合成引物，用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法进行扩增，用ABI3730xl测序仪(美国Applied Biosystems公司)以Sanger测序法进行测序，测序结果与目标区域捕获测序后的结果进行比对。此外，用于聚合酶链反应的所有引物都是通过引物优先5.0设计的(正向，5′-CCATTGGAACATTCGTCCAG-3′，反向，5′-TACCATGGGAAGTTTGAAGGC-3′)。

结 果

一、家系资料及遗传学特征

图1为该家系的谱系。该家系为一三代常染色体显性遗传家系，13例家系成员中4例患病，1例已逝，患者男女比例为1：1。所有患者均表现为双眼晶状体脱位。先证者为1名14岁的女性患者(III-1)，身高1.74 m，双手指细长，双眼晶状体向颞上方脱位(图2)，伴有长眼轴、高度近视，心脏内科检查无明显器质性病变，骨科 X 光检查未见脊柱侧弯。II-1患者身高1.91 m，双手指细长，于13年前行心脏超声心动图检查，提示有主动脉瘤样扩张和二尖瓣脱垂并行二尖瓣置换术，于7年前因双眼晶状体脱位行双眼白内障超声乳化和人工晶状体植入术，X光检查有脊柱侧弯。III～2患者10岁，身高1.65 m，双手指细长，双眼晶状体向颞上方脱位，伴有长眼轴、中度近视，心脏内科检查无明显器质性病变，于1年前行骨科X线检查见脊柱侧弯已行手术治疗。

图1 先天性晶状体脱位的家系图

图2 先证者的眼前节照相

二、遗传学检测结果

高通量测序检测结果证明该家系的先证者有一错义突变，位于FBN1 c.3965A>G(p.D1322G)。Sanger测序证实，这种新的突变仅存在于所有其他受影响的家庭成员中，但不存在于未受影响的成员和正常对照中(图3)。可见，该基因突变与疾病表型完全共分离。另外，PolyPhen2和SIFT预测这种新的CRYBB1变体对CRYBB1的功能具有高度破坏性。不同物种中FBN1氨基酸序列的比对显示天冬氨酸在1 322位高度保守(图4)。

图3 Sanger测序峰图

图4 FBN1基因的突变分析

讨 论

MFS是一种显性遗传性结缔组织疾病，主要临床特征是长骨过度生长、EL和AO，其中约80%患者会出现EL[8，9]。1991年，Dietz等[10]首次报道了FBNl基因的突变会导致MFS。随后，1996年建立的Ghent标准强调了阳性基因发现的重要性并有助于将MFS与具有类似症状的其他疾病区分开[11]。与1996年的Ghent标准[11]相比，2010年新修订的Ghent标准[3]加大了AO和EL在MFS诊断中的权重并再次强调了FBNl基因检测是诊断MFS的重要手段。应注意的是，EL患者，特别是在年轻时多有典型的FBNl基因突变导致的骨病表现但无心脏病变，这使EL 与 MFS 很难区别[12]。

本研究采用靶向外显子测序对先证者进行可能的致病基因的筛查，而后用Sanger测序法在其余家系成员和100位健康人上验证，得出该晶状体脱位家系的基因突变位点是位于第33个外显子的杂合错义突变，患者均表现为双眼颞上方晶状体脱位。仅在家系II代中发现主动脉瘤样扩张但未发现其他患者有 MFS 的心血管表现，从样本病例数量上也不能提供有效遗传连锁分析证实 FBN1 基因是该患者主动脉瘤样扩张的致病基因。根据2010年新修订的Ghent标准[3]，该家系目前只能诊断为“晶状体脱位综合征“(ectopia lentis syndrome，ELS)。Détaint等[13]发现对于FBN1 基因突变致 MFS的患者，升主动脉扩张的患病率会随其年龄的增长而升高，建议对 20 岁以前的 EL 患者诊断需长期随访后再下定论。因此，需要长期临床随访后才可确诊本 EL 家系是否为 MFS。

随着测序技术的快速发展，高通量测序已成为遗传病基因筛查的主流方法。截至2018年3月，HGMD数据库中已有2 000多个FBNl基因的突变位点，其中2/3为错义突变[14]。FBNl是一个大基因(全长235kb)，定位于15q21.1，包含65个外显子，编码一个由五结构域和2 871个氨基酸组成的细胞外蛋白—原纤维蛋白-1[15]。原纤维蛋白-1是一种聚合成微纤维的结构大分子，其中微纤维存在于所有结缔组织中，并组装成组织特异性结构框架[16]。 蛋白质组学研究表明，原纤维蛋白蛋白-1是睫状小带中最丰富的蛋白质[17，18]，在小鼠模型中敲除FBN1显示小带破裂[19]。可见，FBNl基因突变会导致晶状体脱位。另外，该家系患者均有长眼轴、中高度近视的特点，这可能是由于原纤维蛋白—1参与巩膜组织的构成[6]。

本研究在一个晶状体脱位家族中发现了一致病的基因突变位点，即FBN1基因外显子33中的c.3965A>G(p.D1322G),该突变导致第1 322个天冬氨酸转变为甘氨酸,并通过生物信息学分析预测对CRYBA1具有高度破坏性，这与国外的报道[20]相吻合，但Rachel等[20]仅说明其为MFS的致病基因突变位点并未说明相关的临床表型。因此，该研究为晶状体脱位家系的遗传咨询和产前基因诊断提供了坚实的证据。