脂联素、瘦素及其受体基因多态性与妊娠期糖尿病患病关联性分析

张丽娟，吴宇碧*，曾定元，刘坤友

(柳州市妇幼保健院 广西妇产疾病临床医学研究中心 1.产科；2.质量办，柳州 545001)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期最常见的并发症之一，是指妊娠期间首次确认的糖代谢异常(不包含孕前已经存在的1型糖尿病和2型糖尿病)。其可能导致严重的新生儿疾病如巨大儿、新生儿低血糖症，或导致母体先兆子痫等短期并发症，以及母亲及其后代患2型糖尿病、肥胖和心血管疾病的长期风险[1]。GDM的发生是由于胰腺β细胞功能下降和胰岛素抵抗增加所导致，它是一种代谢并发症，尤其好发于与胰岛素抵抗相关的肥胖女性中[2]。

瘦素和脂联素是调节胰岛素分泌、胰岛素敏感性以及葡萄糖和脂质代谢的脂肪因子。瘦素是ob基因的产物，由脂肪细胞分泌，可调节脂质代谢。有研究表明，血清瘦素水平升高与糖尿病、脂质紊乱有关，并且其是心血管疾病的危险因素[3]。其合成具有遗传背景，受瘦素基因遗传多态性的调控。脂联素在脂肪组织中产生并调节各种代谢过程，包括葡萄糖和脂质代谢以及脂肪酸氧化。脂联素具有降低胰岛素抵抗、改善脂质代谢及抗炎的作用。在代谢综合征、糖尿病、血脂异常和肥胖症患者中已观察到血浆脂联素水平降低[4]。之前有研究表明，脂联素和瘦素单核苷酸多态性(SNP)基因分型与糖尿病、代谢综合征和肥胖症之间存在显著关联[5-6]。但尚未见多个SNP的联合研究报道。因此，本研究对GDM孕妇外周血脂联素和瘦素及其受体基因的7个SNP位点多态性进行分析，旨在探讨脂联素和瘦素及其受体基因的SNP位点多态性与GDM发生的可能关系。

资料与方法

一、研究对象

本研究为病例对照研究。

按照GDM筛查和诊断标准[7]，孕妇在孕24～28周时进行75 g葡萄糖耐量试验(OGTT)，出现空腹血糖≥5.1 mmol/L、服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L、2 h后血糖≥8.5 mmol/L三项中任何一项者，即可诊断为GDM，纳入病例组；OGTT结果正常者视为葡萄糖耐量正常(NGT)，纳入对照组。

病例组的排除标准：孕前患有1型和2型糖尿病、自身免疫性和炎症性疾病、肿瘤疾病和慢性感染以及拒绝参加本研究的患者。

对照组排除标准：孕前患有1型和2型糖尿病、既往妊娠GDM、自身免疫性和炎症性疾病、肿瘤性疾病和慢性感染以及拒绝参加本研究的患者。

根据病例组和对照组的纳入、排除标准，共收集2019年1—12月在我院常规产检的156例NGT孕妇为对照组，162例GDM孕妇为病例组。

本研究中所有样本监测和采集过程均获得我院伦理委员会的批准(批文号20170010)。

二、脂联素和瘦素及其受体多态性基因位点的确定

进行外周血DNA检测。选择脂联素ADIPOQ1基因SNP位点rs266729、rs17300539，ADIPOQ2基因SNP位点rs1501299、rs2241766，脂联素受体ADIPOQR1基因SNP位点rs1539355，瘦素OGDH基因SNP位点rs12112075和瘦素受体LEPR基因SNP位点rs1137101共7个SNP位点多态性(表1)。

三、脂联素和瘦素及其受体位点的引物信息

针对上述7个SNP位点，设计了扩增引物和延伸引物(表2)。

续表

表2 脂联素和瘦素及其受体位点的引物信息

四、单碱基末端延伸(SNaPshot)PCR扩增流程

根据DNA抽提试剂盒的流程，提取研究对象的DNA，经过多重PCR扩增(扩增引物1∶1混合)后，将PCR产物分装，进一步经SNaPshot PCR扩增，按比例混合延伸引物，加入消化完的模板DNA 1.0 μl混匀，设定反应程序：96℃，10 s；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s；25个循环。保存于4℃。读取研究结果。

五、统计学分析

结 果

一、两组研究对象人口学信息和临床特征

本研究共纳入318例孕妇，其中156例NGT孕妇(对照组)，162例GDM孕妇(病例组)。两组比较，病例组的分娩孕周显著小于对照组，孕前体质量指数(BMI)和孕前体重、空腹血糖和糖化血红蛋白及剖宫产率显著高于对照组(P均<0.05)(表3)。

表3 两组研究对象人口学信息和临床特征分析[(-±s)，n(%)]

二、两组研究对象脂联素/脂联素受体、瘦素/瘦素受体基因检测位点基因型分布和等位基因频率

1.脂联素ADIPOQ1基因SNP位点：rs266729的GG基因型、等位基因G在病例组的分布频率较对照组显著降低(P<0.001)(表4)。

2.脂联素ADIPOQ2基因SNP位点：rs1501299的TT基因型、等位基因T在病例组的分布频率较对照组显著升高(P<0.001)；rs2241766的GG基因型、等位基因G在病例组的分布频率较对照组显著升高(P<0.001)(表5)。

表4 脂联素ADIPOQ1基因两个SNP位点基因型分布和等位基因频率[n(%)]

表5 脂联素ADIPOQ2基因两个SNP位点基因型分布和等位基因频率[n(%)]

3.脂联素受体ADIPOQR1基因SNP位点：rs1539355基因型分布及等位基因频率比较均无统计学差异(P>0.05)(表6)。

4.瘦素及瘦素受体基因：瘦素基因OGDH及瘦素受体基因LEPRSNP位点的基因型分布及频率在两组间均无统计学差异(P>0.05)(表7)。

表6 脂联素受体ADIPOQR1基因SNP位点基因型分布和等位基因频率[n(%)]

表7 瘦素及瘦素受体基因SNP位点基因型分布和等位基因频率[n(%)]

三、脂联素基因多态性与GDM患病风险的单因素和多因素分析

1.单因素分析：将结果变量NGT定义为0、GDM定义为1，将自变量中每一个SNP位点的野生纯合子定义为0、杂合子和突变纯合子定义为1，纳入上述基因型频率差异分布的3个SNP位点rs266729、rs1501299和rs2241766基因型分布数据进行单因素分析。结果显示：病例组SNP位点rs266729与rs1501299、rs2241766的基因频率分布与对照组均存在显著差异性(P均<0.05)(表8)。

2.多因素分析：将3个位点的基因型分布纳入到多因素Logistic回归分析，选择向后LR模式，结果显示：rs266729与rs2241766位点突变可致GDM患病风险增加，其OR(95%CI)分别为4.09(2.08，8.06)和2.77(1.63，4.74)(P<0.001)(表9)。

四、脂联素基因-基因多态性的交互作用分析

为了确定孕妇体内的脂联素基因是否存在交互作用导致GDM发生的风险增高，对两组研究对象有频率分布差异的3个基因位点进行了基因-基因间的交互作用分析，结果显示，脂联素ADIPOQ1基因SNP位点rs266729与ADIPOQ2基因SNP位点rs2241766的分布之间存在交互作用，二者的联合作用导致GDM患病风险增加[OR(95%CI)为4.83(1.57，11.42)，P<0.001](表10)。

表8 脂联素基因SNP位点多态性的单因素分析

表9 脂联素基因SNP位点多态性的多因素分析

表10 脂联素基因-基因多态性的交互作用单因素分析

讨 论

全球GDM的患病率在过去几十年中呈持续上升趋势。根据国际糖尿病联合会(IDF)的数据，2017年全球GDM的患病率为14%，其中非洲为9%、北美为12.6%、亚洲为21%[8]。一项调查东亚和东南亚地区GDM患病率的荟萃分析显示，中国GDM的发病率为11.91%，远高于日本、韩国和泰国的8.0%[9]。由于经济发展和生活水平提高及生活方式的改变，以饮食模式的变化和缺乏身体活动为特征，加之对GDM筛查的重视，中国GDM患病率急剧上升。包括25项横断面研究或回顾性研究在内的涉及79 064名中国孕妇的一项荟萃分析表明，根据国际糖尿病协会和妊娠研究组(IADPSG)诊断标准，中国GDM的总患病率为14.8%[95%CI(12.8%，16.7%)][10]。

作为糖尿病前期状态，GDM通常与高胰岛素血症和胰岛素抵抗有关，但GDM的病理生理学尚不明确。脂联素和瘦素是研究较多的与糖尿病及GDM相关的脂肪因子，其中脂联素及瘦素基因多态性的研究尤为广泛。体内脂联素水平受遗传的调控[11]。脂联素是ADIPOQ基因的产物，该基因长度约15.8 kb，包含3个外显子，位于染色体3q27上，该染色体与代谢综合征、2型糖尿病和心血管疾病的易感位点相关[11]。ADIPOQ基因常呈多态性，其常见遗传变异对血浆脂联素水平的影响及其与不同代谢特征的关联受到越来越多的关注。研究结果显示，ADIPOQ1基因SNP位点rs266729的小G等位基因与白种人和亚洲人的脂联素水平降低、空腹血糖升高、胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病、糖尿病肾病和代谢综合征有关[12]。已有较多的文献报道了rs266729位点多态性与GDM患病的相关性。如一项荟萃分析结果显示，rs266729位点的GG/GC基因型可增加亚洲人和欧洲人患GDM的风险，其OR(95%CI)分别为2.08(1.01，4.27)和1.52(1.03，2.25)[13]。本研究结果与上述的研究相反，GDM患者携带GG/GC基因型和G等位基因的频率低于非GDM患者，我们分析认为不排除人种差异的关系，并且有文献报道在GDM患者中发现罕见基因G起了一定的保护作用，而常见的C等位基因与GDM患病风险相关[12]。已有研究发现妊娠特异性β1糖蛋白与脂联素基因启动子相关，其过表达增强了基因启动子的活性。rs266729位点的G等位基因改变了转录因子Sp1结合位点的DNA序列，导致脂联素基因启动子的转录活性降低[14]。此外，根据基因组序列中DNA甲基化的位置，其结果会产生不同的遗传效应。如基因启动子和基因间区域会发生甲基化并导致基因沉默，最终影响基因在发育过程中的表达。rs266729启动子区域的DNA甲基化与多态性相互作用可能导致ADIPOQ1基因表达受到抑制[15]。另一方面，脂联素基因的转录活性在妊娠期间根据新发育胚胎的需要而改变，这可能涉及相应调节因子的活性和/或结合的变化；由rs266729改变的序列可能在孕妇和非孕妇的脂肪细胞中发挥不同的作用。因此，G等位基因会降低非妊娠个体中ADIPOQ的表达，它可能会使启动子对与妊娠相关的抑制反应减弱[12]。以上两点可能可以部分地解释GDM患者的G等位基因的保护作用。本研究未发现瘦素及其受体与GDM发生之间的关系，这与既往报道[16-17]不一致，可通过更大样本的研究进一步探讨。

已有的文献证据提示ADIPOQ2基因SNP位点rs2241766多态性与个体糖尿病、肥胖和代谢综合征的易感性有关[11，18]。一项研究表明，ADIPOQ2基因SNP位点rs2241766的GG位点和等位基因G的高频率分布是导致糖尿病肾病患病的主要危险因素，其OR(95%CI)为1.51(1.16，1.95)[15]。本研究结果表明，ADIPOQ2基因SNP rs2241766的GT/GG基因型和G等位基因更常见于GDM孕妇。此结果与既往的研究报道[19-20]一致。一项在伊朗的孕产妇人群中的研究显示，与TT基因型相比，GT/GG基因型发生GDM的风险高2.5倍，在调整了包括孕龄、胰岛素抵抗指数和糖化血红蛋白在内的混杂因素后，这种关联仍然存在[19]。另一项纳入了22项研究，包括1 461名GDM孕妇和1 592名非GDM孕妇的荟萃分析结果显示，与TT基因型相比，GT/GG基因型发生GDM的风险升高[OR(95%CI)为1.43(1.23，1.67)]；携带G等位基因发生GDM的风险是携带T等位基因的1.41倍[95%CI(1.25，1.56)][20]。

由于复杂的疾病往往由多重因素相互作用引起，基因与基因、基因与环境间的交互作用分析将会提高检测因果关系的能力，从而有可能增加对疾病遗传学的了解。已有研究揭示，脂联素基因与其他基因的SNP位点交互作用可导致疾病的发生，如有文献报道了ADIPOQ1 rs266729与脂联素基因的其他SNP位点存在基因-基因交互作用可增加结直肠癌的患病风险[21]。此外，也有研究报道了ADIPOQ2 rs2241766位点与其他基因的SNP位点存在基因-基因交互作用可增加结直肠癌的患病风险[22]。但目前尚未发现有关于ADIPOQ1基因rs266729与ADIPOQ2基因rs2241766的基因-基因交互作用对疾病影响情况的报道。本研究报道了ADIPOQ1基因SNP位点rs266729与ADIPOQ2基因SNP位点rs2241766的基因-基因交互作用可增加GDM的患病风险。

综上，脂联素ADIPOQ1基因SNP位点rs266729和ADIPOQ2基因SNP位点rs2241766突变可能增加GDM的患病风险，两个SNP位点之间的交互作用与GDM的发生有关。