磁性多孔PLGA微球制备及其功能化研究

顾加雨 张 超 史乐乐 夏 炎

(江苏省计量科学研究院医学所，南京 210046)

引言

聚合物微球是通过单体聚合而形成的球形聚合物颗粒，易于制备、调控及复合，广泛应用于药物缓释递送等多个领域[1]。微球是粒径尺寸为1 ～250 μm 的球状实体[2]，具有小尺寸效应、表面效应、单分散性、多样性及稳定性，将其与磁性纳米颗粒结合，制成兼具磁性纳米颗粒和高分子微球特性的复合型磁性聚合物的研究越来越活跃。磁性聚合物复合微球具有易加工、成本低、比表面积大、易于吸附、较好的生物相容性及磁响应性等优点，可作为负载药物的优良载体，并且可在外加恒磁场的作用下实现分离纯化与定向操纵，在外加交变磁场作用实现快速升温，为构建兼具磁感应热疗与磁控药物释放的多功能载体提供了有效手段。同时，磁性聚合物微球可以方便地进行基团表面改性(如-NH2、-OH、-COOH、-SH 等)和进一步功能化修饰，如连接药物、荧光分子、特异性抗体等[3]，赋予磁性聚合物微球更广泛的应用前景。目前，聚合物磁性微球已经在细胞分离、药物负载、固定化酶、热疗栓塞等生物医学领域有着广泛的应用研究[4]。

近年来，具有优良的生物可降解特性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作为FDA 批准的可用于人体的药物载体材料，受到学术界越来越多的关注[5]。PLGA 是由乳酸(lactic acid，LA)和羟基乙酸(glycolic acid，GA)按照一定比例聚合而成，同时具有两种材料的优势。PLGA 作为一种可降解聚合物，在体内可以进一步代谢，最终降解生成CO2和H2O，并无毒副作用，因此成为多种药物的缓释载体[6]。

磁性纳米材料具有优异的磁学性能和独特的生物相容性，普遍用于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、靶向药物递送、磁热疗、生物标记与分离、生物催化、生物传感器等生物医学工程领域[4]。而Fe3O4纳米颗粒作为最早被FDA批准的临床使用的纳米材料，在基础研究领域和技术应用领域有广泛研究[7]。

本研究采用简单易于实现的溶剂挥发法制备包载油溶性Fe3O4纳米颗粒的PLGA 磁性微球，同时溶剂挥发还导致微球具有多孔结构，易于通过简单吸附而实现CT 造影剂、荧光分子等的复合，并对微球的形貌结构、药物吸收与释放行为以及磁感应热性能进行了研究。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及仪器

主要试剂包括:聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，50:50，5000，山东省医疗器械研究所，中国)，吐温80(国药集团化学试剂有限公司，中国)，二氯甲烷(DCM，国药集团化学试剂有限公司，中国)，聚乙烯醇(PVA，31000，Aladdin 公司Aladdin 公司)，Fe3O4＠OA(南京东纳生物有限公司，中国)，碘海醇(100 mL:30 g，扬子江药业集团有限公司，中国)，罗丹明B(479.01，Aladdin 公司Aladdin 公司)。实验所用试剂均为分析纯，所用水为超纯水。

主要仪器包括:高速剪切乳化器(FA25，德国Fluko 公司)；超声波仪(RQ45，上海声仪有限公司，中国)；机械搅拌器(D2 004 W，上海梅颖浦仪仪器仪表制造有限公司Aladdin 公司)；高速离心机(Cebtrifuge 5430R，德国Eppendoff 公司)；电子分析天平(XS105DU，瑞士梅特勒托利公司)；光学显微镜(ECLIPSE E200，日本尼康株式会社)；场发射扫描电子显微镜(Ultra Plus，德国Zeiss 公司)；激光扫描共聚焦显微镜(SP8，德国Leica 公司)；紫外分光光度计(UV-3600日本Shimadzu 公司)；振动样品磁强计(VSM 7407，美国Lakeshore 公司)；交变磁场(SPG-60-II/III； 深圳双平磁感应仪器有限公司，中国)。

1.2 PLGA-Fe3O4＠OA 微球的制备

PLGA-Fe3O4＠ OA 微球的制备采用溶剂挥发法。首先，配制1%及0.3%浓度的PVA 水溶液(外水相)；其次，将120 mg PLGA 溶于5 mL 二氯甲烷中，超声震荡溶解，待充分混合后加入Fe3O4＠ OA纳米颗粒[(Fe3O4＠OA/PLGA)%=5%]，超声使其充分混合(油相)；将外水相中加入适量的表面活性剂Tween 80，将混合均匀后的油相置于外水相中，室温下以500 r/min 低速搅拌过夜，挥发有机溶剂使微球固化；最后离心洗涤，冷冻干燥备用。

1.2 磁性微球形貌表征

取适量冷冻干燥后的微球分散于蒸馏水中，然后分别滴加到玻璃片、锡箔纸上，室温干燥后用光学显微镜及扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)分析所制备样品的外貌及形状。

1.3 磁性微球表面成分的测定

取少量所制备的材料，将其固定在导电胶上，利用扫描电子显微镜中的元素分析仪进行碘元素测定( mapping)及能量谱( energy dispersive spectrometer，EDS)测定。

1.4 磁性微球吸附碘释放情况研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的碘溶液中，室温下摇床震荡孵育5 h 洗涤、滴样以备检测后，将样品继续在摇床上震荡孵育。分别取再孵育0.5 和1 h 的样品进行Micro-CT、扫描电子显微镜中的元素分析仪进行碘元素测定。Micro-CT 值计算时，1/25/50/75/100 分别代表选取第1、25、50、75、100 层进行平均数值计算。

1.5 磁性微球孔结构的研究

取少量制备材料于5 mL 去离子水中复溶，然后取10 mg 的水溶性荧光染料罗丹明B 加入上述溶液，室温下摇床震荡4 h。取少量荧光微球于载玻片，激光共聚焦显微镜观察其结构分布。

1.6 磁性微球吸附罗丹明释放的研究

取一定量的磁性微球加入1 mg/mL 的罗丹明B的PBS 溶液中，室温下摇床震荡孵育，并分别于0.5、1、2、4、6、8 h 磁分离，用纯水洗涤后用紫外分光光度计测量。

1.7 磁热效应测试

磁性高分子微球的磁热效应实验是由交变磁场(alternating current magnetic field，ACMF)发生装置完成。取适量的磁性高分子微球(Fe 浓度已知)于EP 管中，放置于磁感热线圈内，插入测温光纤，设置参数后开启交变磁场及测温装置，记录数据。比吸收率(specific absorption rate，SAR)表示每单位材料质量在单位时间内所产生的热量多少，常用于衡量磁性材料在交变磁场的升温效率，表示为[8]

式中，C表示样品比热容，dT/dt为起始斜率，ms 为样品质量，mFe 为样品中Fe 的质量。

2 结果

2.1 PLGA 磁性微球形貌分析

光镜下微球呈圆形，且分布均匀，如图1所示。由图可见，所制备的微球呈球形较圆整，但表面较粗糙，有助于药物的吸附，往往会引起药物的高突释[9]。粒径为10～15 μm，微球粒径较小，导致药物向外流失面积越大，流失越多，包封率下降[10]。

图1 磁性PLGA 微球的光学显微镜和扫描电子显微镜图像Fig.1 The optical microscope and scanning electron microscope( SEM )imageofmagnetic PLGA microspheres

2.2 PLGA 磁性微球表面成分测定

图2为磁性微球的SEM 图像、元素mapping 图及微球EDS 元素分析图。如图2(a)所示，在磁性微球中含有多种元素存在，包括C 元素、O 元素及Fe 元素(图中虚线框所示)；图2(b)进一步证实了微球中含有一定量的Fe 元素，Fe 元素所占原子百分比为0.62 %，证明已成功合成含有Fe3O4＠ OA的磁性聚合物微球。

图2 磁性 PLGA 微球表征。(a)SEM mapping；(b)EDS 分析Fig.2 Magnetic PLGA microspheres. (a)SEM mapping； (b)EDS analysis

2.3 PLGA 磁性微球碘吸附实验

2.3.1 不同孵育时间碘的释放

室温下与碘海醇溶液震荡孵育，于不同时间取样所做mapping 如图3所示。由图可见，随着孵育时间延长，碘元素发生变化。当磁性微球与碘海醇溶液共孵育5 h 后，碘吸附量最多，图片亮度最大，且此时的碘元素大部分都集中在微球表面，吸附量较多，如图3(a)所示。而由图3(b)和(c)中可以明显看出亮度变暗，碘元素开始向周围扩散。在2 h的时候，磁性微球中碘元素亮度最低。上述结果说明CT 造影剂碘海醇能够有效吸附到PLGA 磁性微球内部，并且随着时间增加逐渐释放，在2 h 之内仍然含有较多的碘海醇。

图3 碘海醇不同孵育时间的SEM 元素映射图像。(a)0 h；(b)0.5 h；(c)2 hFig.3 The SEM element mapping images of iohexol for different incubation times. (a)0 h； (b)0.5 h；(c)2 h

2.3.2 不同孵育时间Micro-CT 定量结果分析

将PLGA 磁性微球与碘海醇溶液孵育，待成功吸附碘海醇后用纯水洗涤后保存在水溶液中，分别在0、0.5、1 h 时取样，进行Micro-CT 测试。表1中数据是未吸附碘海醇的磁性微球以及吸附后不同释放时间点的样品的CT 值，按扫描断层编号选取图片计算平均值而得，CT 值越大，说明材料吸收越强。从表中可以看出，对于不同的扫描断层，变化趋势是一致的，未吸附碘海醇的样品CT 值明显小于吸附后的样品。随着释放时间增加，CT 值减小，在1 h 时CT 值仍维持较高水平。

表1 含碘海醇的磁性PLGA 微球在不同释放时间的平均显微CT 值Tab.1 Average micro-CT values of magnetic PLGA microspheres with iohexol at different release time

2.4 PLGA 磁性微球罗丹明B 吸附实验

2.4.1 PLGA 磁性微球孔结构研究

为了证明上述实验中的碘海醇是通过PLGA 磁性微球的多孔结构进行负载的，将荧光染料罗丹明B与PLGA 磁性微球进行孵育，如果存在孔结构，罗丹明B 则能够分散在孔道中，利用激光共聚焦显微镜可观察出其分布情况，结果见图4，所示为磁性微球不同截面的共聚焦成像。图中红色发光物质为罗丹明B，罗丹明B 越多，则图片越亮。可见溶剂挥发法制备的PLGA 磁性微球内部分布着大小不均一的孔洞，而且联通性较高，罗丹明B 通过孔洞进入微球，较多吸附在微球孔壁上。微球不同扫描层面上红色荧光分布不均一，说明微球内部孔道分布不均匀。微球在有机溶剂挥发固化的过程中，高分子首先在球心凝聚形成1 个核，而后逐渐向外挥发聚集，此时随着有机溶剂的挥发带走了部分有机物，孔道由内而外形成。

图4 含有罗丹明B(红色)的磁性PLGA 微球在不同扫描层面上的激光共聚焦图像Fig.4 The laser confocal images of magnetic PLGA microspheres containing rhodamine B ( red)at different scanning levels

2.4.2 PLGA 磁性微球吸附罗丹明B 释放研究

图5为不同时间用纯水洗涤后的罗丹明B 释放情况。结果显示，罗丹明B 在初始时释放迅速，4 h后释放速度开始减缓，在8 h 时释放达到饱和，表明可以将磁性微球在使用前与药物分子简单混合，吸附后用于介入给药，从而可实现不同药物的负载和释放。

图5 罗丹明B 在不同时间的累积释放Fig.5 Accumulated release of rhodamine B at different times

2.5 PLGA 磁性微球磁学性能研究

磁性纳米材料的磁特性一般受尺寸、形貌等多种因素影响。图6(a)显示的磁滞回线为采用振动样品磁强计(vibrating sample magnetometer，VSM)的测试结果，说明纳米颗粒具有良好的磁学性能，矫顽力和剩磁几乎为零，说明具有超顺磁性，其饱和磁化强度为33.9 emu/g Fe。饱和磁化强度对材料在交变磁场下的热升温能力有重要影响，因此，用光纤测温器测量了600 s 内的升温情况。其发热性能在加交变磁场作用下随时间的变化如图6(b)所示。在外加交变磁场作用下600 s 后，最高温度可达55.6℃。目前研究表明，肿瘤细胞对热比较敏感，当温度达到或高于42℃时可以更有效地杀死肿瘤细胞以达到治疗的效果[11]。采用SAR 值来衡量纳米颗粒在交变磁场诱导下的热效率，计算得SAR 值为47.42 W/g Fe。

图6 PLGA 磁性微球在交变磁场下的性能测试。(a)水相中的磁滞回线；(b)时间－温度曲线Fig. 6 Performance test of PLGA magnetic microspheres under alternating magnetic field. (a)Hysteresis loop in aqueous phase； (b)Timetemperature curves

3 讨论和结论

本研究的实验结果显示，PLGA 包裹后并不改变其超顺磁性。利用激光共聚焦观察磁性微球孔洞结构，为后续载药提供了理论依据。此外，通过研究碘及罗丹明B 的吸附释放行为，表明PLGA 磁性微球可以用来持续时间的CT 造影，并且具有明显的缓释功能。上述结果皆说明PLGA 高分子复合磁性微球是一种常用的药物携带载体。可能影响释放行为的主要原因有:1)制备PLGA 微球时有部分药物在微球表面，易形成突释；2)PLGA 质量以及微球制备时仪器选择等均能影响吸附释放行为[12]。PLGA 磁性微球具有良好的超顺磁特性与磁感应热疗能力，为未来构建兼具磁感应热疗与磁热药物控释的多功能载体奠定了基础。

本研究采用简单的溶剂挥发法制备了包裹Fe3O4＠OA 的PLGA 磁性微球，其直径约10～15 μm，溶剂挥发导致微球具有多孔结构。以CT 造影剂碘海醇和荧光分子罗丹明B 作为模型分子进行吸附和释放研究，结果表明这些分子可以被有效负载到微球的多孔结构之中，并且具有一定的药物缓释特性。CT 造影剂和荧光分子负载同时为发展多模态影像学指导药物递送提供了可视化手段。

(致谢:感谢东南大学张宇教授的指导；感谢南京东纳生物科技有限公司提供的技术支持)