细胞坏死抑制剂TAK-632治疗急性胰腺炎的疗效及分子机制

沙如拉, 秦瑞海, 王熠伟, 达胡拉巴艺拉

(1. 内蒙古自治区人民医院 肿瘤内科, 内蒙古 呼和浩特, 010017;2. 内蒙古自治区第四医院 内科, 内蒙古 呼和浩特, 010010)

急性胰腺炎(AP)是多种病因引起的胰酶激活从而引起胰腺组织的自身消化、水肿、出血，甚至坏死，继而导致胰腺局部炎症反应[1-2]。胰腺组织的坏死程度决定了AP患者的预后。细胞程序性坏死是由肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族以及Toll样受体(TLR)家族、DNA依赖性干扰素调节因子激活因子(DAI)等与其对应的配体结合诱发的细胞死亡[3-4]。研究[5-6]显示，细胞程序性坏死与AP发生密切相关，参与了AP的进展过程，能够有效阻断细胞程序性坏死路径，有助于减慢患者AP进程。TAK-632是强效泛Raf抑制剂，目前研究[7]显示, TAK-632可作用于细胞程序性坏死过程中受体相互作用蛋白 (RIP) 1和RIP3，进而调节细胞程序性坏死。本研究探讨TAK-632对AP的治疗作用机制，为临床治疗AP提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

60只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠(体质量约200 g)购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号为SCXK(沪)2015-0005, 伦理审批号为HP2019-029; HE染色试剂盒购自上海碧云天生物有限公司; 牛磺酸胆酸钠购自美国Sigma公司; 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6) 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒购自美国R&D公司; 血清淀粉酶试剂盒购自上海仁捷生物有限公司; RIP3、混合谱系激酶结构区域样蛋白(MLKL)、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL兔多克隆抗体购自美国CST公司，HRP标记羊抗兔二抗购自上海生工生物有限公司。

1.2 分组、动物模型建立及治疗

将60只大鼠随机分为对照组、模型组和TAK-632组，每组20只，模型组和TAK-632组大鼠经腹腔注射0.3%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉，备皮消毒。在上腹剑突下做切口进入腹腔，暴露十二指肠和胰胆管，并在胰胆管远端按钮胆管靠近肝门处用血管夹夹闭，于十二指肠乳头附近将0.45 mm头皮针经十二指肠穿入肠腔，逆行插入胰腺并用血管夹固定。微量泵推注5.00%牛胆酸钠溶液，结束后观察5 min, 待周围组织出现棕红色后拔出头皮针，取下血管夹，使十二指肠复位，关闭腹腔。对照组手术时不泵入牛黄胆酸钠。建模后24 h后对照组和模型组大鼠经腹腔注射生理盐水, TAK-632组大鼠经腹腔注射25 mg/kg TAK-632。

1.3 大鼠血清淀粉酶检测

对照组、模型组和TAK-632组大鼠治疗72 h后，采集静脉血，分离血清，测定血清淀粉酶的活性。

1.4 HE染色及评分

3组大鼠麻醉处死后，采用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成厚度6 μm的切片。采用二甲苯脱蜡，梯度无水乙醇水化后，苏木精染色5 min, 流水冲洗。5.00%乙酸分化1 min, 流水冲洗，分化后颜色成为蓝色。伊红染色1 min, 流水冲洗。再采用70.00%、80.00%、90.00%、100.00%酒精处理各10 s, 二甲苯处理1 min, 中性树胶封片。显微镜下观察胰腺组织病理学改变，采用Spormann标准进行组织病理学评分。

1.5 ELISA检测血清炎症因子

采用ELISA试剂盒检测大鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子表达水平，根据试剂盒说明书执行操作步骤。构建TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子浓度的标准曲线，利用标准曲线计算得到吸光值。

1.6 蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测蛋白表达

对照组、模型组和TAK-632组大鼠处理后，取胰腺组织，加入组织裂解液，充分匀浆后, 15 000 转/min离心30 min, 收集细胞上清液，采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE, 并转移至PVDF膜上，封闭液室温封闭1 h, 采用RIP3、MLKL、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL在4 ℃下孵育12 h, 次日采用聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯(PBST)洗涤3次，每次5 min; 然后采用羊抗兔二抗室温封闭1 h, 采用发光液显影。

1.7 统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，计量资料比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠存活率比较

对照组大鼠生存状态良好，全部存活，存活率为100.00%。模型组大鼠出现精神萎靡、动作迟缓、运动能力下降、颤抖等症状，其中5只大鼠死亡，存活率75.00%。TAK-632组大鼠活动能增强，精神状态好转，大鼠全部存活，存活率为100.00%。与对照组和TAK-632组大鼠存活率比较，模型组大鼠存活率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3组大鼠胰腺组织病理学比较

对照组大鼠胰腺组织结构完整，无炎症细胞浸润、组织充血、水肿、纹理紊乱等症状。模型组大鼠胰腺组织细胞排列紊乱，可见大量炎症细胞浸润，并伴有大量凋亡坏死、充血和水肿症状。经TAK-632治疗后，大鼠胰腺组织纹理、水肿、充血等症状明显缓解。模型组大鼠胰腺组织病理学评分高于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)。TAK-632组大鼠病理学评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

A: 对照组; B: 模型组; C: TAK-632组。图1 对照组、模型组和TAK-632组大鼠胰腺组织病理学结果(放大200倍)

表1 对照组、模型组和TAK-632组大鼠胰腺组织病理评分和血清淀粉酶比较

2.3 3组大鼠血清淀粉酶比较

与对照组比较，模型组大鼠血清淀粉酶活性增加，差异有统计学意义(P<0.05)。TAK-632组大鼠血清淀粉酶活性高于对照组，但低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4 3组大鼠血清炎症因子比较

ELISA结果显示，模型组外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TAK-632组外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于模型组，但高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

pg/mL

2.5 3组大鼠程序性坏死通路蛋白水平比较

Western blot结果显示，对照组、模型组和TAK-632组大鼠胰腺组织总RIP3和MLKL蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠胰腺组织磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TAK-632组大鼠胰腺组织中磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 对照组、模型组和TAK-632组大鼠胰腺组织程序性坏死通路蛋白表达水平比较

3 讨 论

AP是一种以胰腺腺泡细胞坏死为主要特征的危重疾病[8]。细胞坏死伴随于AP的整个过程，主要由炎症因子所介导[9-10], 细胞坏死过程是一种依赖于RIPK1和RIPK3激酶活性的细胞死亡方式，死亡信号诱导RIPK3激酶的激活，进而磷酸化细胞坏死的特异性执行蛋白MLKL[11]。磷酸化的MLKL发生寡聚化并转位到细胞膜结构上，导致细胞膜和细胞器膜破坏，以致细胞死亡和胞内物质外漏[12]。本研究采用牛黄胆酸钠诱导大鼠发生AP, 可见大鼠胰腺组织出现明显炎症细胞浸润，并伴有大量凋亡坏死细胞，并出现充血和水肿症状。与对照组大鼠比较，建模后大鼠血清炎症因子、TNF-α、IL-1β和IL-6水平、病理学评分和血清淀粉酶等指标显著增高。磷酸化RIP3和MLKL水平显著上调，提示AP大鼠胰腺组织出现了明显坏死等细胞生物学现象。

TAK-632是细胞程序性坏死的抑制剂，细胞水平可作用于RIPK1和RIPK3激酶，影响激酶活性，进而影响细胞程序性坏死[13-14]。本研究结果显示, TAK-632处理AP后可显著缓解AP临床症状，降低胰腺组织病理学评分以及血清淀粉酶等指标，说明TAK-632对AP具有治疗作用。

作用机制分析结果显示, TAK-632可显著下调AP大鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症水平。炎症因子所致的级联反应是造成胰腺组织凋亡和坏死的主要因素，可加速AP的发病和进程，其中TNF-α是细胞程序性坏死的主要诱导因子，可与胰腺细胞表面的TNFR结合，促进蛋白激酶RIP1和RIP3传导死亡信号并形成坏死复合体，诱导细胞坏死[15-16]。RIP3和MLKL是细胞程序性坏死过程中的核心蛋白，其磷酸化可激活细胞程序性坏死。本研究发现, TAK-632并不影响AP组织中RIP3和MLKL蛋白表达水平，但可显著下调磷酸化RIP3和MLKL水平，进而抑制细胞程序性坏死。

综上所述, TAK-632可显著下调AP大鼠炎症水平，抑制细胞程序性坏死信号通路，进而缓解AP, 降低AP大鼠的病死率。