白芍总苷对HaCaT细胞外泌体的影响及机制研究

李 燕, 秦夏莲, 沈 艳

(江苏省无锡市第八人民医院 皮肤科, 江苏 无锡, 214000)

银屑病为临床常见皮肤病，激素、免疫抑制剂是其主要治疗药物，但副作用大，复发率高。目前，银屑病的发病机制尚未阐明，有学者[1]认为角质形成细胞增殖与银屑病密切相关。白芍总苷具有抗炎、止痛及调节免疫力的功效，已被用于多种疾病的治疗中[2-3]。近年来研究[4]发现，白芍总苷对银屑病疗效显著(无论是单独用药还是联合用药)，且副作用小，但确切机制尚不清楚。外泌体是一种细胞外囊泡，是微环境中细胞间通讯的重要载体，参与细胞间信息传递。相关研究[5]显示，银屑病患者外周血中性粒细胞分泌的外泌体中炎性因子水平相较中性粒细胞更高，提示外泌体在银屑病发病中可能发挥着一定作用。本研究探讨白芍总苷对HaCaT细胞生物学行为、外泌体分泌的影响及其可能机制，以期为银屑病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞株及仪器

白芍总苷(美国TargetMol 公司), HaCaT 细胞(美国Sciencell Research Laboratories); 杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)培养液、双抗、胰蛋白酶(天津中奥天元生物有限公司); 引物序列(苏州金维智生物有限公司); 兔抗人CD63、CD81、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)及β-actin多克隆一抗、鼠抗兔单克隆二抗(Abcam公司，英国); Transwell小室(美国Coring公司); 四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒，RNA提取试剂盒(北京Biosharp公司); 聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生物有限公司)，蛋白印迹试剂盒(北京索莱宝公司); 酶标仪(美国bio-rad公司), ABI 7900 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司), Tecnai F30 G2型号场发射透射电子显微镜(美国赛默飞公司)。

1.2 细胞培养及分组

用DMEM培养基培养细胞(37 ℃, 5%CO2培养)，当细胞融合度达到80%后用胰酶消化，离心，每孔100 μL(细胞密度2×105个/mL)接种于96孔板中，分别加入50、100、200 μg/L白芍总苷培养液(分别设为低剂量组、中剂量组、高剂量组)，同时设对照组(加入等量完全培养液)，每组3个复孔。

1.3 MTT实验

按照1×104个/孔细胞密度将细胞于96孔板培养24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT孵育4 h, 去培养液后加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO), 水平摇床30 min, 测量吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组A值-白芍总苷组A值)/对照组A值×100%。

1.4 Transwell实验

采用无Matrigel基质胶和有Matrigel基质胶的Transwell小室分别进行细胞迁移实验和侵袭实验。迁移实验: 上室加入200 μL细胞密度为5×104个/mL的培养基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，孵育48 h, 4%多聚甲醛固定10 min, 0.5%结晶紫染色10 min。清洗晒干，计算细胞数量。侵袭实验: 无血清DMEM: 稀释基质胶为1∶6, 每个Transwell小室中加40 μL Matrigel基质胶, 37 ℃孵育半小时。去除培养液，其余同迁移实验。

1.5 外泌体蛋白提取及检测

取处理后继续培养24 h后的各组细胞，用胰酶消化，采用超速离心法提取外泌体, 1 500 转/min离心10 min, 弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后再以36 000 转/min离心20 min, 220 nm无菌滤膜过滤, 30 000 转/min离心90 min, 小心吸尽上清液并丢弃，沉淀即为外泌体。用10 μL细胞裂解液孵化20 min, 常温下36 000 转/min离心20 min, 留取上清液，即为外泌体蛋白。

1.6 透射电子显微镜观察外泌体

将细胞的纯化外泌体重悬于PBS中，滴入电子显微镜格栅中吸收10 min, 然后将吸收的外泌体用2%磷钨酸(pH值6.8)进行5 min负染色，于白炽灯下风干后，使用透射电子显微镜(PHLIPS-TECNAI 10)在120 kV下进行电镜观察。

1.7 蛋白质印迹法(Western Blot)检测外泌体相关指标和通路相关指标蛋白表达量

取处理后继续培养24 h后的各组细胞，加入裂解液，冰浴30 min, 40 ℃ 1 500 转/min离心5 min, 去上清液，离心，取10 μL待测。取此前提取的外泌体蛋白10μL, 按照说明书要求检测蛋白浓度。配胶，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 2 h, 清洗，转膜, 3%脱脂牛奶4 ℃封闭2 h, 清洗，依次加入CyclinD1(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、PI3K(1∶1 200)、p-PI3K(1∶1 000)、CD63(1∶1 200)、CD81(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000), 清洗，加入二抗，孵育2 h, 清洗，增强化学发光法曝光，采用Image J软件分析处理，结果用目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示。

1.8 实时荧光定量PCR法检测细胞中CyclinD1、Akt、p-Akt、PI3K的mRNA表达

取处理后继续培养24 h后的各组细胞，加入1 mL Trizol, 然后依次加入氯仿、异丙醇等提取RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增，目标引物序列见表1。反应体系: SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 2μL, 加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至总体积为25 μL。反应参数: 95 ℃ 预变性2 min, 然后进行循环(94 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s、68 ℃延伸30 s，共45个循环), 75 ℃构建溶解曲线。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 目标引物序列

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 白芍总苷对细胞增殖能力的影响

培养0、24 h时, 4组细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 培养48、72 h时，细胞增殖抑制率由高至低排列依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。为进一步探讨白芍总苷对细胞周期的影响，本研究检测了周期蛋白CyclinD1的表达情况，结果显示, CyclinD1蛋白表达量和CyclinD1mRNA相对表达量由低至高排列均依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A: 细胞增殖抑制率; B: CyclinD1蛋白表达量; C: CyclinD1蛋白的Western Blot结果; D: CyclinD1mRNA相对表达量。与对照组比较, *P<0.05; 与低剂量组比较, #P<0.05; 与中剂量组比较, △P<0.05。图1 各组细胞增殖抑制率、CyclinD1蛋白表达量及CyclinD1 mRNA相对表达量比较

2.2 白芍总苷对细胞迁移、侵袭能力的影响

细胞迁移实验和侵袭实验结果显示，迁移细胞、侵袭细胞数量由低至高排列依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各组间差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。

A: 细胞迁移实验和侵袭实验结果; B: 各组迁移细胞数量比较; C: 各组侵袭细胞数量比较。与对照组比较, *P<0.05; 与低剂量组比较, #P<0.05; 与中剂量组比较, △P<0.05。图2 各组迁移细胞、侵袭细胞数量比较

2.3 各组细胞外泌体鉴定结果

电子显微镜观察结果显示，外泌体表现出典型的圆盘形态，见图3。CD63、CD81蛋白表达水平由低至高排列均依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各组间差异有统计学意义(P<0.05), 见图4。

图3 外泌体电镜扫描结果(放大倍数20倍)

A: CD81蛋白表达量比较; B: CD63蛋白表达量比较; C: Western Blot结果。与对照组比较, *P<0.05; 与低剂量组比较, #P<0.05; 与中剂量组比较, △P<0.05。图4 各组细胞外泌体蛋白CD63、CD81表达

2.4 各组细胞中Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表达量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K mRNA表达水平

Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表达量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3KmRNA表达水平由低至高排列依次为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、图6。

A: Western Blot结果; B: 各组p-Akt/Akt蛋白表达量比较; C: 各组p-PI3K/PI3K蛋白表达量比较。与对照组比较, *P<0.05; 与低剂量组比较, #P<0.05; 与中剂量组比较, △P<0.05。图5 各组Akt、p-Akt、PI3K及p-PI3K蛋白表达水平

A: 各组p-Akt/Akt mRNA相对表达量比较; B: 各组p-PI3K/PI3K mRNA相对表达量比较。

3 讨 论

银屑病是皮肤科常见病，主要病理改变为角质形成细胞增殖、侵袭能力增强，凋亡抑制，同时伴随炎性细胞、血管的异常浸润[6]。目前，临床治疗银屑病的多数药物如维A 酸类药物、甘草酸苷和甲氨蝶呤等均可抑制角质形成细胞增殖[7]。白芍总苷是从白芍中提取的化合物，具有抗炎、抑制肿瘤、调节免疫力等功效，对免疫系统疾病、荨麻疹及银屑病等疗效显著[8-9], 但其治疗银屑病的确切机制目前尚不清楚。

研究[10]发现，白芍总苷可以抑制角质形成细胞的增殖及血管内皮生长因子的分泌。角质形成细胞在银屑病进展中发挥重要作用，HaCaT细胞也称为表皮角质形成细胞系，其是由角质形成细胞培育而来，保留了角质形成细胞分化能力的永生细胞。本研究观察了白芍总苷对HaCaT细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，结果表明，白芍总苷可抑制HaCaT细胞的增殖、迁移及侵袭能力，且抑制作用随着浓度的升高而增强。本研究还检测了周期蛋白CyclinD1的表达水平，结果显示，白芍总苷可抑制细胞CyclinD1蛋白、CyclinD1mRNA表达水平，且抑制作用随着浓度的升高而逐渐增强，进一步印证了白芍总苷对HaCaT细胞增殖的抑制作用。由此推测，白芍总苷通过抑制角质形成细胞的增殖、迁移等达到治疗银屑病的目的。

外泌体是一种杯状、脂质双层的膜囊泡，也是细胞间信息交流的载体[11]。外泌体中有微小RNA、蛋白质和脂质，这些物质被转运到其他细胞内后发挥着重要的作用。本研究采用超速离心法分离出HaCaT细胞外泌体，检测其特异性蛋白表达情况，结果显示，白芍总苷可抑制外泌体蛋白CD63、CD81的表达，且具有剂量依赖性，说明白芍总苷能够抑制HaCaT细胞外泌体的释放，从而抑制细胞恶性生物学行为。

研究[12]显示, Akt与P13K形成P13K/Akt信号通路。Akt通路的激活能够抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，多种肿瘤的发生发展与Akt通路异常有关[13]。银屑病发生发展过程中, HaCaT细胞的增殖和凋亡失衡发挥重要的作用[14]。CHAMCHEU J C等[15]发现，在咪奎莫特诱导的鼠淀粉样皮炎模型中, PI3K/Akt信号活性是增强的，且抑制PI3K/Akt信号通路可缓解咪奎莫特诱导的鼠淀粉样皮损。JEON Y J等[16]报道，抑制PI3K/Akt信号通路可以缓解皮肤的炎症反应。王昊等[17]利用免疫组化法检测寻常型银屑病组织中角质形成细胞内PI3K、Akt蛋白表达情况，结果显示, PI3K、Akt蛋白在寻常型银屑病组织中高表达，与抑制凋亡蛋白Survivin表达呈正相关。本研究结果显示, 3种剂量白芍总苷组HaCaT细胞PI3K、Akt蛋白表达水平均低于对照组，且随着白芍总苷浓度的升高，蛋白含量越来越低，提示白芍总苷通过PI3K/Akt信号通路抑制HaCaT细胞的生物学行为。

综上所述，白芍总苷能够抑制HaCaT细胞分泌外泌体，并抑制HaCaT细胞增殖、侵袭及迁移，其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关，具体的分子机制有待进一步研究。