益生元对益生菌生长代谢的研究

王 新，王 利，王青云，王占东，张居典

（北大荒完达山乳业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150078）

随着人们生活水平及健康意识的提高，益生菌及益生元越来越多的被用于酸奶发酵。益生菌是一类可定植于肠道，可改善人体微生态平衡，发挥有益作用并且具有生物活性的微生物总称。益生菌具有改善肠胃、防治腹泻、增强人体免疫力等功效[1]。益生元不被宿主消化吸收，但可被益生菌利用发酵，从而促进肠道益生菌的繁殖和新陈代谢，是一类可以改善宿主健康的功能物质。目前常用的益生元是功能性低聚糖，一般由2～10个单糖分子组成，具有一定功能特性，属于寡糖类物质[2-3]。将益生元应用在益生菌酸奶中，具有协同增效的作用。益生元作为益生菌的养料，选择性刺激益生菌繁殖、促进代谢，赋予益生菌在菌群中的优势，从而有益宿主健康[4]。本研究选取低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉6种益生元成分，选取复合益生菌（干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）为益生菌，益生元单独与复合益生菌组合制备益生菌酸奶，通过测定益生菌酸奶的活菌数、胞外多糖产量、产酸能力和风味物质双乙酰含量等指标，为益生元在益生菌酸奶中的研究与应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低聚果糖；低聚半乳糖；低聚异麦芽糖；低聚木糖；聚葡萄糖；抗性糊精；菊粉；复合益生菌（干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）；液体MRS培养基。

1.2 仪器与设备

天平、pH计、生化培养箱、超净工作台、紫外可见分光光度计、离心机、烧杯、称量勺和温度计。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基制备

（1）液体MRS培养基（葡萄糖培养基）的制备。葡萄糖20 g、牛肉浸粉10 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、CH3COONa·3H2O 5 g、柠檬酸三铵2 g、吐温-80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、Mn-SO4·4H2O 0.05 g，定溶于1 L去离子水中，115 ℃灭菌20 min[5]。

（2）益生元培养基的制备。益生元培养基不添加葡萄糖，其他成分相同，葡萄糖分别用20 g/L低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉替代，添加的益生元均经过0.22 µm水相过滤器过滤。

1.3.2 菌种活化

将冷冻保藏的0.1 g复合益生菌（干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）冻干粉接入活化培养基，振荡使菌体混合均匀，37 ℃，厌氧条件下振荡培养24 h。所得菌液按体积分数10%接入新的活化培养基，37 ℃，厌氧条件下培养24 h，制得菌种母液[6]。

1.3.3 乳酸菌活菌数测定

葡萄糖培养基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培养基，接种量为1%，置于37 ℃，厌氧培养48 h后测乳酸菌活菌数。乳酸菌菌落总数测定参考《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》 （GB 4789.35—2016），分析发酵过程中益生元对益生菌促增殖能力的影响。

1.3.4 产酸能力测定

葡萄糖培养基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培养基，接种量为1%，置于37 ℃中，厌氧培养48 h后，使用pH计对酸度进行测定，分析发酵过程中益生元对益生菌促产酸能力的影响。

1.3.5 胞外多糖产量测定

葡萄糖培养基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培养基，接种量为1%，置于37 ℃中，厌氧培养48 h后，取10 mL发酵液，离心处理（4 000 r/min， 15 min），取上清液，用浓度为1 mol/L的NaOH将上清液调整pH至7.5，加入1/10体积的胰蛋白酶液（质量浓度为3 g/L，现配现用），40 ℃水浴酶解 2.5 h。加入1/3体积Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，体积比），振摇30 min，离心（4 000 r/min，15 min），除去沉淀，重复1次。加入3～5倍体积的乙醇（体积分数为95%），充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），离心（4 000 r/min，15 min），得沉淀。将沉淀用丙酮洗涤脱水2次，干燥得白色粉末即为多糖,采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖的质量浓度[7-8]。

1.3.6 双乙酰产量测定

葡萄糖培养基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培养基，接种量为1%，置于37 ℃中，厌氧培养48 h后测定样本中的双乙酰含量，选择邻苯二胺比色法测定双乙酰含量，邻苯二胺和双乙酰反应合成2,3-二甲喹喔啉，该化合物在335 nm下具有最大吸收峰[9-10]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌活菌数测定

由表1可知，低聚木糖培养基中的乳酸菌活菌数含量最高，为2.2×109CFU/g，然后依次为低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚异麦芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，整体看来与葡萄糖碳源比较，7种益生元均对益生菌有增殖作用。益生元可促进益生菌繁殖，原理是菌体通过分泌相关酶作用于益生元，将其分解为基础营养物质，从而促进菌体代谢与繁殖[11]。益生菌酸奶的功能性主要取决于活菌数的多少，若要酸奶中的益生菌定植于肠道并发挥作用，摄入量是关键。

表1 不同益生元对益生菌活菌数的影响

2.2 产酸能力测定

由图1可知，低聚木糖培养基pH值最低为3.71，pH值由低到高依次为低聚木糖、低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚异麦芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，pH越低说明产酸能力越强，从统计结果可以看出，益生元促进益生菌的产酸能力与益生元促进益生菌生长呈正相关。益生菌在益生元的作用下快速繁殖，此过程会产生大量短链脂肪酸，可有效降低pH值。在人体肠道中，适宜的pH值有利于维持益生菌的黏附能力，促进其生长和定殖，肠道pH值降低可有效抑制有害菌的繁殖，促进益生菌的繁殖[12]。

图1 不同益生元对益生菌产酸能力的影响

2.3 胞外多糖产量测定

采用苯酚-硫酸法测定不同培养基胞外多糖产量，如图2所示。抗性糊精培养基胞外多糖产量最高，然后依次为聚葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚异麦芽糖和葡萄糖。胞外多糖是乳酸菌生长代谢过程中分泌到胞外、具有独特理化性质和生理功能的一类高分子糖类化合物，属于微生物次级代谢产物。胞外多糖除了具有增稠、保湿、乳化和稳定等常规理化特性外，还具有抑制癌细胞生长、增强机体免疫力、降低胆固醇以及调节胃肠道等多种生理功能[13-14]。

图2 不同益生元对益生菌胞外多糖产量的影响

2.4 双乙酰产量测定

采用邻苯二胺比色法测定不同培养基双乙酰产量，如图3所示。低聚果糖培养基双乙酰产量最高，然后依次为抗性糊精、低聚半乳糖、菊粉、低聚异麦芽糖、低聚木糖、葡萄糖和聚葡萄糖。在发酵乳制品的风味中,双乙酰被认为是重要的风味物质,它可以赋予产品以独特的芳香风味[15]。研究双乙酰的生成途径、生成条件及代谢方式，有助于改善发酵乳制品的风味品质。

图3 不同益生元对益生菌双乙酰产量的影响

3 结论

益生菌和益生元对维持肠道运转稳定和人体微生态健康具有重要意义。益生菌与益生元组合使用，具有协同增效的优势，益生元是益生菌的养料，并且具有选择刺激益生菌生长、激活益生菌代谢，赋予益生菌优势性能。根据上述试验探究得到，益生元的使用可增加益生菌单独使用的功效，提高其活菌数以及产酸能力，促进其代谢产物的增加。低聚木糖可有效促进复合益生菌（干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）的增殖，提高其产酸能力；抗性糊精可显著提高胞外多糖的生成；低聚果糖对代谢过程双乙酰的生成具有明显作用。以上研究对产品开发具有一定的指导意义，对后期复合益生元的研究提供了一定基础。