检测实验室参加畜禽产品中兽药残留能力验证 质量控制探索

滕 爽，吕青骎，包月红，钱 行，王 玮

（南京农业大学食品科技学院/农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心（南京），江苏南京 210095）

能力验证（Proficiency Testing，PT）是利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能 力[1-4]。对于食品检验机构来说，能力验证是重要的外部质量评价活动和实验室质量监控的重要手段，是实验室认可机构和实验室用户评定食品检测实验室检测能力的主要依据之一，也是食品检测实验室进行自我评定的重要尺度[5-8]。食品检验机构通过参加能力验证，可以全面检验实验室的各方面工作，提升检验人员的检测能力和质量体系的管理水平，为实验室提供评价其出具数据可靠性和有效性的客观证 据[9-14]。检测实验室每年制定质量控制计划，定期参加能力验证，是保证检测能力水平的重要手段，也是资质认定和机构考核的必须要求。

随着国民经济水平的提高，人们对畜禽产品的需求日益增多，在促进我国畜禽养殖业发展的同时，因用药不当等因素，兽药残留严重危害我国畜禽产品的质量安全，并对消费者的身体健康和生命安全造成了严重的危害[15-17]。兽药主要包括抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类和β-肾上腺素能受体阻断剂等七大类[18]。磺胺类（Sulfonamides，SAs）和氟喹诺酮类（Fluoroquinolones，FQs）药物，作为广谱抗菌药，因其具有抗菌谱广、抗菌能力强、价格低廉等优点，已被广泛应用于兽医临床和畜牧养殖业中[19-22]。饲养过程中滥用抗菌药物，会在动物体内造成药物残留，经食物链进入人体后，对人的身体健康造成严重危害，并导致许多细菌产生耐药性[23-27]。我国2019年发布的《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中明确规定在动物性食品中的磺胺类、氟喹诺酮类兽药最大残留限量（Maximum Residue Limits，MRLs）[28]。目 前 检 测 动 物 源 性食品中的氟喹诺酮和磺胺的标准方法主要为液相 色 谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS/MS），而HPLC法是目前常用的比较经济实用的检测手段，既可满足动物性食品中兽药残留的准确定性、定量检测，也由于价格因素配置普遍，更适用于各类基层检验检测实验室[29-36]。

为提升和强化检测实验室对畜禽产品中的兽药残留检测能力，本实验室连续多年参加农业农村部农产品质量安全监管司组织的畜禽产品中的兽药残留能力验证。考核项目包括鸡肉中的恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、沙 拉 沙 星（Sarafloxacin，SAR）和 达 氟 沙 星（Danofloxacin，DAN），猪 肉中 的 磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺 胺 甲 噁 唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺 胺 二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）和磺胺喹噁啉（Sulfamethoxazole，SQ）。本文就2020—2021年参加畜禽产品中的兽药残留能力验证过程、结果进行分析，讨论检测过程中质量控制的关键点，总结能力验证过程中把握关键点获得满意结果的经验，以期为各级各类农产品检验检测实验室通过能力验证和提升检测质量提供一定的路径与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉（含磺胺类药物）能力验证样品、鸡肉（含氟喹诺酮类药物）能力验证样品由中国兽医药品监察所提供；磺胺类药物阴性生鲜猪肉和氟喹诺酮类药物阴性生鲜鸡肉均由农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心（南京）提供。

标准物质：恩诺沙星、环丙沙星、盐酸沙拉沙星、甲磺酸达氟沙星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（德国Dr. Ehrenstofer公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，美国Fisher公司）；磷酸（H3PO4）、氢氧化钠（NaOH）、三乙胺（C6H15N）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、冰乙酸（CH3COOH）、正丙醇（C3H7OH）和无水硫酸钠（Na2SO4）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪（配2489紫外检测器、2475荧光检测器）、碱性氧化铝固相萃取柱 （2 g/6 mL，美 国Waters公 司）；XS105电 子 天平（感 量0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；PRACTUM612-1CN电 子 天 平（感 量0.01 g）、advance EDI& pro VF纯水仪、D-16C台式冷冻离心机（德国Sartorious公司）；VORTEX GENIUS3涡旋混匀器、HS 501数显型混匀器（德国IKA公司）；STAR A221 pH测定仪、Syncronis C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）（美国Thermo公司）；Bond Elut C18固相萃取柱（200 mg/3 mL，美国Agilent公司）。

1.3 实验方法

根据能力验证文件规定，各单位可自行选择现行有效，且有检测限和（或）定量限以及回收率规定的方法。因此，本实验室分别采用农业部1025号公告-14-2008《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 高效液相色谱法》和农质发〔2014〕5号文附件8《磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法》，进行鸡肉中氟喹诺酮类兽药残留和猪肉中磺胺类兽药残留考核。

1.3.1 氟喹诺酮类药物残留检测前处理

称取2.00 g样品（精确到0.01 g）于50 mL离心管中（能力验证样品使用领样的离心管，无需转移，以免损失和污染），加10.0 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7），涡旋振荡1 min，使肉样完全分散，超声萃取5 min后，280 r/min中速振荡20 min， 4 ℃下10 000 r/min离心5 min，取上清液于另一新的 50 mL离心管中。残渣中加入10.0 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7），涡旋1 min，280 r/min中速振荡10 min，4 ℃下10 000 r/min离心5 min，合并2次上清液，混匀，备用。

取5.00 mL上清液，经过依次用2 mL甲醇、 2 mL磷酸盐缓冲溶液预洗的Bond Elut C18固相萃取柱；用1 mL一级水淋洗，挤干；再用2.00 mL 0.05 mol/L磷酸溶液∶三乙胺-乙腈（82∶18，v∶v）洗脱，挤干，收集洗脱液；经0.45 μm滤膜过滤后作为试样溶液。

1.3.2 磺胺类药物残留检测前处理

称取5.00 g样品（精确到0.01 g）于50 mL离心管中（能力验证样品使用领样的离心管，无需转移，以免损失和污染），加入4 g无水硫酸钠，15 mL乙腈，涡旋1 min，使肉样完全分散，混匀器上280 r/min振荡20 min，4 ℃下8 000 r/min速度离心5 min，将上层溶液转移至另一离心管中，下层残渣加15 mL乙腈，涡旋混匀1 min，4 ℃下8 000 r/min速度离心 5 min，合并2次上清液于同一离心管中，加入10 mL 正己烷，280 r/min振荡5 min，4 ℃下8 000 r/min速度离心5 min，取下层液体，加入5 mL正丙醇， 50 ℃旋转蒸发至近干，加3 mL 95%乙腈溶液，涡旋混合1 min，超声2 min，作为备用液。

将上述备用液全部经过3 mL 95%乙腈溶液活化的碱性氧化铝小柱，用5 mL 95%乙腈溶液洗涤鸡心瓶后过柱，挤干；用10 mL 70%乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；加入5 mL正丙醇，50 ℃旋转蒸发至干，加入2.00 mL乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）溶解，涡旋混合1 min，过0.45 μm滤膜后，采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定。

1.3.3 标准溶液的配制

（1）氟喹诺酮标准储备液。精密称取恩诺沙星、环丙沙星、盐酸沙拉沙星各50 mg（精确至0.01 mg），甲磺酸达氟沙星10 mg（精确至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，用0.03 mol/L NaOH溶液溶解并稀释定容，分别得到质量浓度为1 mg/mL的恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和质量浓度为0.2 mg/mL的达氟沙星的单支标准储备液。

（2）氟喹诺酮混合标准工作液。准确移取质量浓度为1 mg/mL的恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和质量浓度为0.2 mg/mL的达氟沙星的标准储备液各100 μL于100 mL容量瓶中，乙腈稀释并定容，配制成质量浓度为1.00 μg/mL的恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和质量浓度为0.2 μg/mL的达氟沙星的氟喹诺酮混合标准工作液。

（3）磺胺标准储备液。精密称取磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉各10 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容，分别得到质量浓度为1 mg/mL的5种磺胺单支标准储备液。

（4）磺胺混合标准工作液。准确移取5种磺胺储备液100 μL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容，得到质量浓度为10 μg/mL的磺胺混合标准 工作液。

1.3.4 色谱条件方法建立

（1）氟喹诺酮类兽药残留的测定。流动相A： 0.05 mol/L磷酸溶液-三乙胺∶乙腈（82∶18，v∶v）；流速：0.8 mL/min；荧光检测器：激发波长280 nm；发射波长450 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

（2）磺胺类兽药残留的测定。流动相B：乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）；流速：1 mL/min；紫外检测器：检测波长270 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

1.3.5 标准曲线的制定

（1）氟喹诺酮标准曲线。准确量取1.3.3中配制的恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和达氟沙星混合标准工作液，用流动相A将恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星稀释成质量浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、 20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL和达氟沙星质量浓 度 为1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL和 20 ng/mL系列混合标准溶液。

（2）磺胺标准曲线。准确量取1.3.3中配制的适量磺胺混合标准工作液，用流动相B稀释成质量 浓 度 为0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、 1.00 μg/mL和5.00 μg/mL系列混合标准溶液。

以上溶液现用现配，以峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，Empower软件绘制标准曲线。

1.3.6 精密度和加标回收实验

（1）精密度。畜禽产品中兽药残留能力验证考核样品均为平行双样，在同等条件下进行样品处理，每个样品重复测定3次，计算平均值，并根据平行样品的检测结果计算精密度。

（2）加标回收实验。在空白鸡肉中分别添加 40 μg/kg、100 μg/kg共2个水平的氟喹诺酮类兽药混合标准品，在空白猪肉中分别添加50 μg/kg、100 μg/kg 2个水平的磺胺类兽药混合标准品，每个浓度设3个平行，以平均回收率（Recovery）评价本批次试验的准确度，并根据平行样品的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）评价精密度。

1.3.7 结果计算

根据保留时间定性，外标法定量。试样中氟喹诺酮类含量按式（1）计算：

式中：X为氟喹诺酮类残留量，μg/kg；c为经标准曲线计算氟喹诺酮残留的浓度，ng/mL；m为样品质量，g。

试样中磺胺类含量按式（2）计算：

式中：X为磺胺类残留量，μg/kg；c为经标准曲线计算磺胺残留的浓度，μg/mL；m为样品质量，g。

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示。

2 结果与分析

2.1 能力验证样品测定

能力验证样品经前处理后上机检测，按照1.3.5绘制标准曲线，氟喹诺酮类兽药在5～100 ng/mL（其中达氟沙星1～20 ng/mL）、磺胺类兽药在0.05～5.00 μg/mL，所有兽药目标物标准曲线相关系数（Correlation Coefficient，R）均达到0.999，能够准确地进行外标法定量。由表1和表2可知，鸡肉能力验证样品中分别检出恩诺沙星（60.0 μg/kg）和环丙沙星（70.0 μg/kg），RSD≤4.040%；猪肉能力验证样品中分别检出磺胺二甲氧嘧啶（110.0 μg/kg）和磺胺喹噁啉（105.0 μg/kg），RSD≤1.540%。

表1 鸡肉中氟喹诺酮能力验证的检测结果

表2 猪肉中磺胺能力验证的检测结果

2.2 加标回收实验

为验证能力验证试验的准确度和精密度，检测考核样时同批次进行2个浓度水平的阳性添加试验。由表3和表4可知，鸡肉中恩诺沙星回收率为85.0%～92.0%，RSD≤2.620%；环丙沙星回收率为84.0%～90.0%，RSD≤1.580%。猪肉中磺胺二甲氧嘧啶回收率为80.4%～92.0%，RSD≤3.810%；磺胺喹噁啉回收率为80.8%～91.8%，RSD≤4.460%。本试验兽药残留检出的回收率均高于80%，RSD小于7.000%，满足HPLC法检测兽药残留的准确度和精密度要求，检测过程中准确度较高。

表3 空白鸡肉中四种氟喹诺酮类药物添加回收率及精密度（n=3）

表4 空白猪肉中五种磺胺类药物添加回收率及精密度（n=3）

3 讨论与结论

3.1 质量控制措施

为确保能力验证检测结果的准确性，实验室在试验准备、实施过程、结果报送中分别按照以下7个方面进行质量控制。

3.1.1 人员

实验室人员需经过培训和考核后方可上岗工作，并通过各类培训、内部考核、质量监督等方式持续提高和考核其业务能力。实验室在多年能力验证的考核中采用骨干引领和以老带新模式，不断为实验室的持续发展培养人才。

3.1.2 仪器与耗材

能力验证试验中使用的液相色谱仪、电子天平、移液器等仪器，对于检测结果有重要影响，必须在检定校准有效期内，可以正常使用。除常规仪器外，色谱柱作为HPLC法分离的核心，其型号的选择也十分重要，有助于提高实验室分析效率。实验室在本项能力验证中选用Syncronis C18色谱柱（美国Thermo Fisher公司），其保留时间和峰面积的重现性优异，能满足HPLC法测定畜禽产品中兽药残留的检测要求。此外，为保证能力验证中色谱柱的分离选择性能，实验室的色谱柱专项专用。

3.1.3 样品

能力验证考核样品应置于低温、密封条件下保存。若收到样品无法立即进行检测时，应将其置于 -20 ℃下储存。试验中质量控制需要进行空白对照和阳性添加，实验室需准备空白样品作为空白基质。实验室在能力验证实验前应对准备的新鲜鸡肉、猪肉空白基质进行仪器确证为阴性，同时还要确保试剂、环境、仪器设备对检测结果无干扰，以确保能力验证工作的顺利开展。

3.1.4 标准物质

实验室为确保出具数据的准确性、公正性和权威性，应使用有证标准物质进行分析测定，可以量值溯源到国家基准。实验室从保存期和稳定性角度考虑，首选固体标准物质，待使用时将其配制成标准储备溶液，再逐步稀释成标准工作溶液，以便获得准确的定量结果。此外，实验室在计算固体标准物质配制成标准储备液的质量浓度时，需以折盐和含量后的药物单体计算。

3.1.5 方法

实验室采用的检测方法应同时满足适应能力验证要求和本实验室实际情况。实验室在能力验证中为获得稳定和准确的定量结果，在HPLC-MS/MS和HPLC方法中，选择了可避免基质效应的HPLC法。

3.1.6 平行试验

平行试验结果是判断检测结果准确性的重要依据之一。本能力验证考核组织单位提供2个平行样品，每个样品经前处理后上机测定，需重复测定3次，以获得该样品的检测值，并计算RSD，以考察其精密度是否满足检测要求。

3.1.7 加标回收

加标回收检测结果是判断同批次其他样品检测质量的依据。加标回收试验一般在空白样品中进行添加，添加量为定量限（Limit of Quantitation，LOQ）1～5倍质量浓度。实验室综合考虑方法LOQ、MRLs和检测线性范围，鸡肉中氟喹诺酮能力验证考核选择2倍LOQ和MRLs进行阳性添加，而猪肉中磺胺能力验证考核选择1倍LOQ和MRLs进行阳性添加。阳性添加样品与考核样品和空白对照样品应同时测定，其中空白对照可避免试验过程中的污染和干扰，而阳性添加可确保本批次试验的准确度和精密度。

3.2 结论

实验室参加能力验证是一项综合性考核工作，实验室在多年的能力验证工作中，通过梳理质量控制的关键因素，并在实践中予以验证，有效提升了实验室的质量体系管理水平和检测质量，为实验室顺利通过能力验证提供了正确路径。本实验室自2015年来参加农业农村部农产品质量安全监管司组织的畜禽产品中的兽药残留能力验证，以人员、仪器与耗材、样品、标准物质、方法、平行试验和加标回收检测7个方面为抓手，在提高实验室的检测质量的同时，其能力验证也均获得了满意结果。