PRR11、HMGA2、ANXA10对结直肠癌TME术后早期复发的预测效能探讨

杨 益,朱丽芳,曾庆亮

杨益,曾庆亮,海警医院肿瘤内科 浙江省嘉兴市 314000

朱丽芳,海警医院检验科 浙江省嘉兴市 314000

0 引言

流行病学调查显示,我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率在多种恶性肿瘤中占第3位,死亡率占第5位,且近年来呈逐渐升高趋势,同时也是风险增加最快的疾病之一.临床多采用全直肠系膜切除(total mesorectal excision,TME)治疗,CRC患者5年生存率具有明显改观,但每年仍有部分患者发生肿瘤复发与转移,临床应积极发掘与其相关的肿瘤分子标志物,预测预后发展.国外相关研究表明,富含脯氨酸蛋白11(prolinerich protein 11,)是肿瘤相关基因,在肝癌组织中表达高于癌旁组织,与肿瘤TNM分期有关,且表达较高患者总生存时间较短,沉默PRR11能明显抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,可见与肝癌恶性生物学行为、预后有关.而Hu等研究表明,高迁移率族蛋白A2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)在胃癌中高表达,能通过MAPK信号通路调节胃癌干细胞的自我更新和致瘤性,而肿瘤干细胞是一类能够导致肿瘤发生、复发的细胞,故推测HMGA2可能与结直肠癌复发有关.根据相关研究,膜联蛋白A10(annexinA10,ANXA10)敲除可诱导N-钙粘蛋白转换为E-钙粘蛋白,促进胃癌癌细胞迁移复发.上述三个因子均与肿瘤发生发展具有密切关联性,因此可将其作为重要肿瘤分子标志物进行检测分析.基于此,本研究选取我院收治的CRC患者231例,并首次探讨PRR11、HMGA2、ANXA10对结直肠癌TME术后早期复发的预测效能.现报告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2016-03/2020-03我院收治的231例CRC患者进行前瞻性研究,均符合《中国结直肠癌诊疗规范(2020年版)》中结直肠癌诊断标准;均行TME术治疗;术前未接受过放化疗、靶向治疗、免疫治疗、中医药等抗癌治疗;均未发生远处转移;术后石蜡标本保存完好;自愿签署知情同意书.排除其他部位恶性肿瘤;肿瘤导致穿孔、梗阻等需急诊手术治疗;合并严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍;TME术禁忌证;导致腹腔粘连的手术史.本研究获医院伦理委员会审核通过,患者及家属知情,自愿加入.

1.2 方法

1.2.1 TME手术方法:根据患者病情及意愿选择完全腹腔镜TME或经肛联合经腹TME手术,并留取新鲜肿瘤组织作为检测标本.

1.2.2 PRR11、HMGA2、ANXA10 mRNA检测:采用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,提取肿瘤组织及细胞总RNA,并测定其浓度与D(260)/D(280)比值,按照反转录试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)说明书将总RNA逆转录为cDNA,最后采用荧光定量PCR试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司)进行定量PCR检测;反应体系为20 μL,反应程序为10 min 95 ℃预变形-15 s 90 ℃变性-10 s 60 ℃退火-15 s 95 ℃延伸,共计40个循环;最终采用2法计算相对基因表达量.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参;各基因引物序列如下:(1)PRR11上游引物为5’-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3’,下游引物为5’-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3’;(2)HMGA2上游引物为5’-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3’,下游引物为5’-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3’;(3)ANXA10上游引物为5’GCATCCATTATGGGATT GAAA-3’,下游引物为5’-CAAAATGTTTTGTGGAGAG TAT G T G-3’;(4)内参G A P D H上游引物为5’-C A GCCTCAAGATCATCAGCA-3’,下游引物为5’-TGT GGTCATGAGTCCTTCCA-3’.

1.2.3 复发判定标准:a局部复发:经肠镜检查重新出现肿瘤原发灶及结直肠周围局部出现病灶;b远隔转移:肝脏、腹膜等部位发生远处转移;并根据术后1年复发情况分为复发组、未复发组.

1.3 观察指标 (1)分析手术情况;(2)比较两组基线资料、、、;(3)比较不同N分期患者、、;(4)比较不同、HMGA2、水平者复发率;(5)采用多因素Logistic回归方程分析、、与复发的相关性;(6)采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析、、对复发的预测价值.

采用SPSS 22.0对数据进行分析,计数资料(%)表示,检验;计量资料采用(mean±SD)表示,多组间比较以单因素方差分析,两两比较以LSD-检验,两组间比较采用独立样本检验对比;等级资料采用Ridit分析;采用Logistic进行多因素回归分析;预测效能分析采用ROC曲线,获取曲线下面积(area under the curve,AUC)、置信区间、敏感度、特异度及Cut-off值,联合预测实施Logistic二元回归拟合,返回预测概率logit(P).均采用双侧检验,α=0.05.

2 结果

2.1 手术情况 231例CRC患者,均顺利完成TME术,其中完全腹腔镜TME 71例,经肛联合经腹TME 160例,无中转开腹病例;随访1年,失访1例,获访230例患者中,25例(10.87%)复发,复发类型:局部复发14例,远隔转移11例.

2.2 两组基线资料、、、比较 两组年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、肿瘤直径、病理类型、T分期、合并疾病、手术方式、术后辅助治疗、是否保肛比较,差异无统计学意义;复发组N分期、手术切缘、淋巴结清扫数目、、、与未复发组比较,差异有统计学意义(＜0.05).见表1.

表1 两组基线资料、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA比较

2.3 不同N分期患者、、比较、N0＜N1＜N2,ANXA10 mRNA:N0＞N1＞N2,两两比较差异有统计学意义(＜0.05).见表2.

表2 不同N分期患者PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA比较(mean±SD)

2.4 不同、、水平者复发率比较 以复发组和未复发组各指标均值为分界(两组、、均值分别为1.28、1.43、1.10),将患者分为低表达与高表达.不同、、水平者复发率比较,差异有统计学意义(＜0.05).见表3.

表3 不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者复发率比较n(%)

2.5 多因素分析 以复发情况作为因变量(0=未复发,1 =复发),纳入N分期、手术切缘、淋巴结清扫数目、、、作为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示,将N分期、手术切缘、淋巴结清扫数目控制后,、、仍与术后复发相关(＜0.05).见表4.

表4 术后复发的多因素Logistic回归方程分析

2.6、、预测复发的ROC 以复发组为阳性样本,以未复发组为阴性样本,绘制各指标预测复发的ROC曲线,结果显示,、、预测复发的AUC依次为0.798、0.768、0.832(＜0.05);将、、原始数据随机划分为训练集(60%)、验证集(20%)、测试集(20%),利用训练集训练出模型,利用验证集验证模型,不断调整模型选出最好的模型,记录最佳模型的各项选择;再利用训练集+验证集数据训练出一个新模型作为最终模型,同时利用测试集评估最终模型,将返回Logit(P)作为独立检验变量,得到、联合的ROC曲线,结果显示各指标联合预测复发的AUC为0.942(＜0.05).见图1、表5.

图1 PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA 预测复发的ROC. ROC:受试者工作特征曲线.

表5 ROC分析结果

3 讨论

CRC发病机制复杂,多数学者认为肿瘤发生的重要原因是癌症防御机制的失活、致癌途径的激活,而TME术后早期复发转移往往是导致治疗失败与死亡的重要原因.临床通过探索新型基因功能与CRC发生发展、转移复发的关系,对揭示其具体分子机制、设计合理的靶向药物及预后判断具有重要意义.

随着目前对CRC发生发展过程中分子机制的深入研究,基因方面成为新型检测手段,通过积极寻找癌症发生发展过程中发挥重要作用的可作为基因治疗靶点的调控基因序列是目前研究热点内容.新型基因PRR11在癌症发生发展中发挥重要作用,但其分子机制尚不明确,目前已证实在食管癌、宫颈癌肺癌、肺癌等多种肿瘤疾病均高表达.而HMGA2在细胞分化增殖方面具有显著表现,与肿瘤产生、组织学分级、淋巴结转移等过程具有密切关联性.基于此,本研究采用PCR法对TME术后采集的新鲜肿瘤组织标本中、基因表达水平进行检测分析,结果显示复发组、高于未复发组,二者水平与复发情况的发生显著相关.细胞周期的调控紊乱在恶性肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,其中PRR11可作用于细胞周期的S期,促进癌细胞由S期向G/M期转换,导致细胞异常增殖,参与调控CRC的发生发展,且与其侵袭转移息息相关.李慧娟等学者研究表明,敲减PRR11会阻滞细胞周期于S期,导致癌细胞增殖减缓,抑制细胞成瘤的再次发生,间接证明本研究结果可靠性.而HMGA2能通过蛋白-DNA或蛋白-蛋白作用方式改变染色体结构,引发DNA发生剧烈变性,从而发挥促进或抑制下游基因表达的作用;或者可通过结合其他转录因子间接调节下游基因表达,促进CRC肿瘤细胞的增殖分化,可能会加速TME术后早期复发的发生.同时,本研究还进行多因素Logistic回归分析,结果显示上述2个因子均为复发的重要影响因素,其水平升高会增加复发风险2倍左右,表明PRR11、HMGA2均为影响CRC患者TME术后复发的独立因子.但PRR11作用是通过作用于Wnt蛋白还是与破坏性复合物结合等具体分子机制,仍需后续相关研究进一步探索分析;而HMGA2虽能激活Wnt信号通路促进CRC增殖过程,但具体调控机制仍有待研究.

已有相关研究证实,膜联蛋白家族成员ANXA6在宫颈癌、ANXA7在胃癌进展中均具有一定影响;而ANXA10作为定位于常染色体4q33上的另一膜联蛋白家族成员,其生物学功能仍有待发掘.对本研究中CRC患者的ANXA10基因表达情况进行分析,结果显示复发患者ANXA10 mRNA水平低于未复发患者,低表达ANXA10患者其复发率明显升高,表明ANXA10表达下调可能是导致CRC转移复发的重要机制之一.马鹏程等学者研究中CRC组织存在明显ANXA10表达缺失现象,其水平降低可能会导致肿瘤细胞进展转移的发生,与本研究结果具有一致性.提示临床可将ANXA10作为CRC复发的独立危险因素,但目前对下调其表达的机制及其是以何种机制促进癌症发生发展知之甚少,临床需更加深入研究.本研究通过绘制ROC曲线进一步探究上述3个因子表达的检测意义,结果显示各指标联合可提高对复发的预测价值,从而证实PRR11、HMGA2、ANXA10对CRC发病机制的丰富、潜在基因治疗靶点的探寻具有重要意义,为提高癌症生存率带来曙光.值得注意的是,本研究两组手术方式均衡可比,保证了各指标组间的可比性,但其基础均为TME术,这种手术方式术后PRR11、HMGA2、ANXA10基因表达水平是否与其它手术方式有区别尚不明确,仍需后续研究进行探讨.

4 结论

综上所述,CRC患者PRR11、HMGA2、ANXA10表达与TME术后早期复发明显密切相关,对预后生存情况具有一定指导意义,有望成为CRC未来靶向治疗的潜在靶点.

近年来我国结直肠癌发病率在恶性肿瘤中占第3位,死亡率占第5位.临床多采用全直肠系膜切除治疗,结直肠癌患者5年生存率具有明显改观,但每年仍有部分患者发生肿瘤复发与转移,其具体原因尚未完全明确.

找出、、等基因表达是否结直肠癌患者全直肠系膜切除术后复发存在相关,为改善患者预后提供参考依据和研究方向.

探讨、、对结直肠癌全直肠系膜切除术后早期复发的预测效能,找出其与全直肠系膜切除术早期复发之间的关系.

选取2016-03/2020-03我院收治的231例结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者进行前瞻性研究,均行TME治疗,根据术后1年复发情况分为复发组、未复发组.比较两组基线资料、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA,并比较不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者复发率,采用多因素Logistic回归方程分析术后复发的相关影响因素,采用受试者工作特征曲线及曲线下面积分析各指标预测术后复发的效能.

复发组N分期、手术切缘、淋巴结清扫数目、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA与未复发组比较,差异有统计学意义(＜0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA:N0＜N1＜N2,ANXA10 mRNA:N0＞N1＞N2,两两比较差异有统计学意义(＜0.05);不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者复发率比较,差异有统计学意义(＜0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA与术后复发相关(＜0.05);各指标联合预测复发的AUC高于单一预测(＜0.05).

CRC患者PRR11、HMGA2、ANXA10表达与TME术后早期复发明显密切相关,对预后生存情况具有一定指导意义,可作为分子标志物协助临床治疗.

通过本研究可以得出PRR11、HMGA2、ANXA10表达对预后生存情况具有一定指导意义,有望成为CRC未来靶向治疗的潜在靶点,但本次研究存在一定局限性,选取例数较少,且均为我院患者,可能存在一定程度的偏倚,建议开展多中心、大样本随机对照试验加以证实.