人口腔鳞癌差异表达谱的全基因组分析

刘远航 张丽茹 仇永乐 刘昕 路月亭 胡燕

口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)具有浸润性强、生长快、易发生颈部淋巴结转移的特点，其发病过程是由多种类基因协同作用所致，并展现出多层次变化[1]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)介导基因调控和表达。研究者发现lncRNA具有治疗靶点和预后指标的潜力，参与许多生物学过程，如细胞增殖、发育过程、炎性反应等，包括癌症在内多种疾病均与其相关[2-4]。以往的研究注重于OSCC蛋白编码基因，但最新研究显示，lncRNA可能介导OSCC发病过程[5-15]。lncRNA PRNCR1作为miR-326“海绵”，上调FSCN1表达，从而促进OSCC发展[6]。lncRNA ZEB1-AS1通过靶向下调miR-23a促进OSCC，并能预测OSCC生存[7]。lncRNA PANDAR与SRSF7的结合上调了PIM1表达，从而促进OSCC发展；而通过CRISPR-dCas9敲减lncRNA PANDAR能降低OSCC增殖和增加OSCC凋亡[8]。lncRNA LHFPL3-AS1作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，通过靶向miR-362-5p/CHSY1通路促进OSCC生长和顺铂耐药[9]。RBPJ过表达的巨噬细胞源性外泌体来源的lncRNA LBX1-AS1通过LBX1-AS1/miR-182-5p/FOXO3通路，抑制OSCC进展[10]。LINC01303在OSCC组织中表达高于癌旁组织，通过竞争性结合miR-429，上调ZEB1表达，从而促进OSCC[11]。lncRNA NR2F2-AS1通过抑制miR-494的甲基化抑制OSCC细胞增殖[12]。lncRNA CEBPA-DT通过CEBPA/BCL2抑制OSCC细胞凋亡，从而促进顺铂耐药[13]。lncRNA HOXA-AS3通过海绵吸附miR-218-5p，从而促进OSCC中癌细胞增殖[14]。lncRNA LINC00152与USF1的相互作用能够增强USF1与MRPL52的启动子结合并激活其转录，间接提高MRPL52表达，从而促进OSCC生长[15]。本研究探讨lncRNA在OSCC发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2015年1月至2016年12月收集72例于石家庄市第二医院和河北医科大学第四医院口腔科手术切除的OSCC组织及对应的正常组织(以距肿瘤边缘>2 cm为标准)，样本切取后立刻存储于-80℃。全部患者病理学诊断明确，病例资料完整，术前均未行放、化疗等治疗。本实验经医院伦理委员会批准，且患者知情同意。

1.2 主要仪器与试剂 Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(德国Qiagen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RR047A、SYBR®Premix Ex TaqTM(大连宝生物TaKaRa公司)；PCR引物(沈阳万类公司)；SBC Human(4×180K)lncRNA芯片(上海伯豪生物公司)。

1.3 总RNA的提取与鉴定 取适量标本组织，通过Trizol法提取总RNA；通过NanoDrop-2000超微量紫外分光光度计、Agilent Bioanalyzer 2100和1%琼脂糖凝胶电泳进行质检，选取合格RNA用于后续实验。

1.4 cDNA合成、标记与杂交 按照Low Input Quick Amp WT Labeling Kit(Agilent公司)及标准操作流程，对合格总RNA进行cDNA扩增、荧光标记、杂交。之后，洗涤杂交完成的芯片并进行扫描。

1.5 芯片数据分析 选取3例口腔鳞癌及正常组织进行芯片检测，其中舌癌1例(T1N2M0)，牙龈癌1例(T2N0M0)，颊癌1例(T3N1M0)。芯片检测可以覆盖当前的核心数据库，如：GENCODE V21(7346)等。

1.6 数据提取及分析 使用安捷伦芯片扫描仪进行芯片扫描，并通过安捷伦genespring GX V11通过软件对数据进行归一化和分析。通过散点图、热图显示差异表达基因。通过差异表达基因Pearson系数筛选共表达基因，建立lncRNA-mRNA共表达网络。对差异表达lncRNA对应的mRNA转录本进行GO和Pathway富集分析，并预测差异表达lncRNA的靶基因。

1.7 qRT-PCR验证 取适量标本组织，通过Trizol法提取总RNA，选取合格RNA逆转录制备cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix进行荧光定量分析。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。内参为GAPDH，并采用2-△△Ct法测定RNA相对表达水平[5]。

2 结果

2.1 差异表达lncRNA和mRNA的数据分析 通过散点图、分层聚类分析，以差异倍数(fold change,FC)>2倍且P<0.05为标准，筛选出显著差异表达lncRNA和mRNA。芯片共筛选出2 294条差异表达lncRNA(933条上调lncRNA，1 361条下调lncRNA)，占所有可检测lncRNA的2.9%；共筛选出1 938条差异表达mRNA(891条上调mRNA，1 047条下调mRNA)，占可检测mRNA的10.3%。见表1～4。

表1 OSCC与正常组织相比表达上调的lncRNA(前15条)

表2 OSCC与正常组织相比表达下调的lncRNA(前15条)

表3 OSCC与正常组织相比表达上调的mRNA(前15条)

表4 OSCC与正常组织相比表达下调的mRNA(前15条)

2.2 lncRNA-mRNA共表达网络图 通过构建lncRNA-mRNA共表达网络，发现306条lncRNA与其他lncRNA或mRNA存在潜在相互作用。其中，lncRNA TMPRSS11BNL(关系度值22)和lnc-WRN-10∶1(关系度值21)是关系度最高的lncRNA，而其他无潜在直接作用的基因，也通过间接作用，与这两条lncRNA发生相互作用。因此，lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1可能是OSCC发病的节点基因。见图1。

图1 lncRNA-mRNA共表达网络图；节点基因lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1与其他基因潜在的相互作用图；圆形代表mRNA，方形代表lncRNA；红色代表上调基因，绿色代表下调基因

2.3 靶基因预测 通过cis和trans调控角度，预测差异表达lncRNA的靶基因。cis调控是对同一染色体上邻近mRNA的转录激活及表达调控，而trans调控是对其他染色体上编码基因的转录激活及表达调控。预测显示，1 470条差异表达lncRNA含有潜在的cis或trans靶基因。其中，1 356条lncRNA可能与1 250条cis靶基因互作，370条lncRNA可能与2 454条trans靶基因互作，256条lncRNA可能同时与cis和trans靶基因互作。GO分析表明，MF靶基因主要富集在分子结合，比如“ion binding”和“anion binding”等。CC靶基因主要富集在细胞膜和细胞器，比如“organelle membrane”和“aggresome”等。BP靶基因主要在合成过程中富集，比如“organic substance biosynthetic process”和“cellular biosynthetic process”等。pathway分析表明，靶基因在43条pathway中显著富集，其中占多数的是肿瘤相关pathway，但是靶基因也富集在“signal pathway”和“metabolism”等其他pathway中。见表5、6。

表5 GO富集度前10位的条目

2.4 GO和KEGG通路分析 基因本体论(gene ontology,GO)包括分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组分(cellular component，CC)。与正常组织相比，OSCC组织上调表达基因中，601条基因与MF相关，599条基因与BP相关，638条基因与CC相关。MF富集度最高的是protein binding，BP富集度最高的是signal transduction，

表6 KEGG富集度前10位的条目

CC富集度最高的是cytoplasm。下调表达基因中，697条基因与MF相关，681条基因与BP相关，753条基因与CC相关。MF富集度最高的是calciumion binding，BP富集度最高的是oxidation-reduction process，CC富集度最高的是plasma membrane。KEGG分析表明，下调表达基因富集的通路183条，富集度最高的是Synthesis and degradation of ketone bodies。上调表达基因富集的通路157条，富集度最高的是Glycosaminoglycan biosynthesis。见图2、3。

图2 GO富集度前30位的条目；A 上调表达基因；B 下调表达基因

图3 KEGG富集度前30位的条目；A 上调表达基因；B 下调表达基因

2.5 qRT-PCR验证 随机挑选10条差异表达lncRNA，在72例OSCC及对应的正常组织中进行qRT-PCR验证。结果表明，lnc-MANSC4-8∶1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1∶3和lnc-GLI3-4∶1在OSCC中显著上调，而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR和lnc-TPP2-7∶2在OSCC中显著下调，这与芯片结果相一致。见表7、8。

表7 芯片数据与qRT-PCR验证结果间lncRNA差异倍数比较

3 讨论

OSCC的早发现、早诊治是癌症研究人员的挑战，而全面掌握OSCC发病分子机制是解决这个问题的关键[16]。研究证实，lncRNA介导的复杂网络能够调控大量的编码基因。此外，研究证实lncRNA与恶性肿瘤的生长、转移、侵袭等生物学过程相关，但作用机制尚未完全明晰[17-19]。

本研究中，通过lncRNA表达谱芯片，我们筛选了OSCC中差异表达基因，根据标准(FC>2,P<0.05)，OSCC中共有2 294条差异表达lncRNA和1 938条差异表达mRNA。为验证芯片数据的准确性，随机选取10条差异表达lncRNA进行qRT-PCR验证，其结果与芯片相符合，说明本研究筛选结果准确而可靠。另外，还发现下调的lncRNA数量占明显优势，暗示下调的lncRNA在OSCC发生发展过程中可能发挥主导作用。

表8 72例OSCC和对应的正常组织中lncRNA标准化水平比较

lncRNA转录模式复杂，能形成多种二级结构，故仅基于其核酸序列预测其生物学功能存在局限性[20]。lncRNA-mRNA共表达网络表明lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1与其他基因的关系度较高。因此，推测这两条关键节点lncRNA介导OSCC发病过程。通过lncRNA-mRNA共表达网络，还发现lncRNA NR_002812作用于SP100和B2M等基因。研究表明，SP100蛋白与病毒感染、病毒相关蛋白互作和自身泛素化调节有关，同时，在干扰素和p53等多种pathway中发挥作用[21]。通过调控磷酸化AKT蛋白，p53蛋白抑制口腔恶性肿瘤的生长和侵袭[22,23]。lncRNA lnc-DHX37-5∶2和lnc-AHNAK2-9∶2可能会对S100 A8蛋白具有调控作用。研究表明，S100 A8蛋白通过Wnt/β-catenin通路参与口腔癌发生发展，并且在口腔癌，食道癌等癌症中表达增加[24,25]。Wnt/β-catenin通路涉及众多生物学过程，介导肿瘤细胞增殖、凋亡、局部侵袭和远处转移。OSCC患者中β-catenin蛋白表达显著升高，重要的是，与OSCC患者预后呈负相关[26]。另一方面，β-catenin通过作用Wnt通路中的靶点，使Wnt通路活化而调节下游靶蛋白C-myc和Cyclin D在转录水平的表达情况[27]。另外，细胞周期蛋白CCND3与本实验筛选出的lncRNA ENST00000583044、NR_104048、NR_ 120366和lnc-WRN-10∶1等均有潜在的相互作用。CCND3表达下调能够提高OSCC对顺铂的敏感性，说明上述4条lncRNA都可能通过CCND3介导OSCC发病过程。综上，lncRNA可能通过直接或者间接调节癌症蛋白编码基因，从而调控OSCC发生发展。

通过GO和KEGG通路分析，探讨lncRNA对OSCC潜在的作用机制，发现差异表达mRNA显著富集在多种MF、BP和CC中，并且显著富集在多条与癌症相关的通路，例如，“Small cell lung cancer”、“Thyroid cancer”、“Bladder cancer”、“Glycerolipid metabolism”等。这些结果表明，OSCC发生发展与细胞结构变化、代谢失调、癌基因及抑癌基因异常等生物学过程密不可分。本研究中，还通过cis和trans调控两种角度，预测差异表达lncRNA的靶基因。cis和trans靶基因的GO和pathway分析表明OSCC发生发展与“细胞器官、合成代谢”等GO term及“癌症”等pathway密切相关。

在本研究中，筛选出的差异表达lncRNA在OSCC发生发展过程中的作用机制尚待研究证实。然而，我们的lncRNA数据及其潜在的靶基因数据，为深入研究lncRNA调控OSCC发生发展及其机制提供了重要的线索，为OSCC诊断与治疗提供新的思路。