火麻仁多肽的制备及减肥功能研究

◎ 徐 梅，王常青，赵大洲

（1.厦门元之道生物科技有限公司，福建 厦门 361100；2.山西大学，山西 太原 030006）

火麻（Cannabis sativaL.）又名汉麻、线麻等，为桑科大麻属一年生草本植物，广泛分布在亚欧的温带和热带地区，成熟的火麻仁种子可提取食用油脂和蛋白质。火麻仁粕是提取食用火麻仁油后的饼粕，蛋白质含量50%～70%，国内外已见到用蛋白酶水解火麻仁蛋白制取多肽的报道[1-2]。现有制备的火麻仁多肽的工艺多采用碱溶酸沉法提取火麻仁蛋白，然后再用碱性或中性蛋白酶水解多肽，获得的活性多肽为抗氧化肽和降压肽，目前尚未见到用多种蛋白酶依次水解火麻仁粕制备具有抑制胰α-淀粉酶和胰脂肪酶活性多肽的报道，也未见到火麻仁多肽减肥功能的实验研究[3-4]。本文用酸性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶3次水解脱脂火麻仁粕，得到的多肽经膜分离后得到了分子量300～6 000 Da的活性多肽，并研究了该多肽对肥胖模型小鼠的减肥效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火麻仁粕，山西宏田嘉利农业科技有限公司；3.350酸性蛋白酶（3.350酶）、537酸性蛋白酶（537酶）、胃蛋白酶、MSD酸性蛋白酶（MSD酶）、3.4310酸性蛋白酶（3.4310酶）和中性蛋白酶，肽度科技（厦门）有限公司；阿卡波糖，德国拜尔公司；奥利司他胶囊，重庆华森制药股份有限公司；α-淀粉酶和胰脂肪酶，Sigma公司；昆明种小鼠SPF级，山西医科大学实验动物中心；动物饲料及辅料，山西医科大学实验动物中心；其他化学试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2600型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）有限公司；高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；超滤-纳滤膜组件，中科瑞阳膜技术（北京）有限公司；全自动定氮仪，上海宝英光电科技有限公司；UVD-680-3紫外检测仪及色谱工作站，上海金达生物科技有限公司；Thermo MR23冷冻离心机，美国热电公司；Spectramax M5多功能酶标仪，天津泰科嘉华金属贸易有限公司；其他均为常规仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 火麻仁多肽的制备与分离

（1）酸性蛋白酶水解制备火麻仁多肽的工艺研究。火麻仁粕粉按料液（质量）比1∶20加水浸泡，调pH值至2.5～3.0，倒入胶体磨磨浆，将匀浆料液等分为8份，分别为L、M、N、O、P、Q、R和S，其中L和M样品加入3.4310酶，N和Q样品加入537酶，O和R样品加入MSD酶，P和S样品加入3.350酶，加酶量5 000 u·g-1，按样品中蛋白计。各样品在50～52 ℃水解70 min后，加热灭酶；然后在M、N、O和P样品中分别加入胃蛋白酶2 600 u·g-1，40～42 ℃水解45 min后加热灭酶，离心取上清液；L、Q、R和S样品不经胃酶水解，离心取上清液。8份上清液经膜分离浓缩后，稀释至15 mg·mL-1检测α-淀粉酶、脂肪酶抑制率，选出消化酶抑制活性高的上清液A保存。

（2）中性蛋白酶二次水解火麻仁粕残渣的时间与温度实验。取上清液A离心得到的沉淀残渣，加入一定量的水和5 000 u·g-1的中性蛋白酶，在pH值为7.5和50 ℃下，分别取样水解60～160 min，将残渣的水解液灭酶后，离心得到上清液B，检测计算B液的多肽得率和15 mg·mL-1含量下的脂肪酶抑制率，以确定适宜水解时间。取上清液A离心的残渣，分别在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和 60 ℃水解 120 min，以确定适宜水解温度。其他工艺条件同上。

（3）火麻仁活性多肽的膜分离筛选方法。将A、B两上清液混合后，分别用截留分子量为10 000 Da、6 000 Da、4 000 Da和2 000 Da的超滤膜和300 Da的纳滤膜分离，得到5个分子量Mw组分（6 000～10 000 Da、4 000～6 000 Da、2 000～4 000 Da、＜2 000 Da和300～6 000 Da）；将5段多肽分离液调整到多肽含量15 mg·mL-1后，测定各肽段的消化酶抑制率和质量百分比（色谱工作站软件），确定最佳活性分子段。

1.3.2 多肽含量的测定方法

多肽含量按《大豆肽粉》（GB/T 22492—2008）中附录B的方法测定。

1.3.3 多肽得率Q的计算方法

多肽得率Q的就算公式如下：

式（1）中：S为水解液（离心或超滤）中多肽的含量，g·mL-1；T为水解液的体积，mL；W为水解原料液中的粗蛋白量，g。

1.3.4 α-淀粉酶和脂肪酶活抑制率的测定与计算

α-淀粉酶抑制率采用3,5二硝基水杨酸比色法测定[5]；脂肪酶抑制率的检测与计算参照文献中方法[6]，其中脂肪酶活力的测定按照《脂肪酶制剂》（GB/T 23535—2009）的方法。

1.3.5 火麻仁多肽的减肥实验方法

选成年雄性小鼠，屏障系统下基础饲料适应喂养7 d，按体重分成5组，分别为基础组、基础+多肽组、高热量模型组、多肽小剂量组和多肽大剂量组。基础组和基础+多肽组动物喂食基础饲料，其余3组动物喂高热量饲料（见表1），每日定量供食，自由饮水，饲养温度为（22±2）℃，湿度40%～60%。基础组和高热量模型组每天灌胃乳清蛋白［1 g·（kg·d）-1］；基础+多肽组每天灌胃火麻仁多肽和乳清蛋白各0.5 g·kg-1；多肽小剂量组［0.8 g·（kg·d）-1］和多肽大剂量组［1.6 g·（kg·d）-1］每天灌胃火麻仁多肽。实验期4周，实验前后称体重，结束后处死动物，摘取睾丸及肾周围脂肪垫称重，计算脂体比和体重增重率。统计摄食量和摄入总热量（摄入总热量=摄食量×每公斤饲料热量），进行分析总结。饲料配方见表1。

表1 饲料配方表

2 结果与分析

2.1 火麻仁多肽最佳工艺条件的确定

2.1.1 酸性蛋白酶+胃蛋白酶最佳组合水解工艺的确定

不同蛋白酶组合水解火麻仁多肽的活性数据如表2所示，所有火麻仁酶解样品均无脂肪酶抑制活性；缺少用胃蛋白酶二次水解的水解液L、R和S没有α淀粉酶抑制活性，537酶一次水解的火麻仁水解液Q的α淀粉酶抑制率为42.5%，但是经过胃蛋白酶二次水解后的水解液N的α淀粉酶抑制率只有22.35%，说明537酶水解多肽的α淀粉酶抑制活性对胃蛋白酶的耐受性差；只有用3.4310酶+胃蛋白酶依次水解的水解液M可产生较高的α淀粉酶抑制率，同时也预示这种活性多肽有一定的过胃稳定性，因此，这两种酶组合的水解工艺作为第一阶段酶解活性肽的优选。将M水解液的离心上清液A冷藏，以备后期合并超滤和检测。将M水解料液的离心沉淀残渣作为第二阶段中性蛋白酶解试验的底物。

表2 不同蛋白酶组合水解火麻仁多肽的活性数据表（多肽浓度 15 mg·mL-1）

2.1.2 沉淀残渣适宜酶解时间的试验结果

采用3.4310酶和胃蛋白酶依次水解得到的火麻仁多肽的α淀粉酶抑制率可达到66.59%，但是火麻仁蛋白的多肽得率只有34%～38%。因此本文将水解M料液的离心沉淀用中性蛋白酶再次水解，结果如图1所示，在水解80～140 min时脂肪酶抑制率变化不大，超过140 min后，脂肪酶抑制率逐渐下降；多肽得率在水解120 min时最高，之后逐渐下降，综合以上两方面因素，确定M料液沉渣水解120 min为中性蛋白酶酶解的适宜时间。

图1 水解时间对多肽得率和脂肪酶抑制率的影响图

2.1.3 沉淀残渣适宜酶解温度的实验结果

从图2可以看出，沉淀残渣在40～55 ℃温度范围内水解，脂肪酶抑制率变化不大；50 ℃时多肽得率最高，低于50 ℃时得率较低，该蛋白酶未发挥出有效活性，高于50 ℃时多肽得率随温度下降较快，可能与水解温度高，酶容易失活有关。因此适宜水解温度为50 ℃。

图2 水解温度对脂肪酶抑制率与多肽得率的影响图

结合前期加酶量和pH值单因素实验（省略未列出），最终确定中性蛋白酶水解M料液沉渣的适宜条件为加酶量5 000 u·g-1、pH值为7.5、温度50 ℃和时间120 min，得到的水解液经离心获得上清液B，供下一步膜分离。

2.2 火麻仁活性多肽的膜分离筛选结果

将上清液B与上清液A合并后，经膜分离得到5个分子量段的火麻仁多肽，检测结果见表3。α-淀粉酶抑制活性高的多肽在4 000～6 000 Da分子段，2 000～4 000 Da段多肽虽有一定活性，但活性较小，有可能是前段的活性大分子从4 000 Da的超滤膜漏出所致；而抑制脂肪酶活性高的分子集中在2 000 Da段以下，2 000～4 000 Da段的多肽也有一定活性，有可能是2 000 Da的超滤膜未将小分子活性多肽全部滤出。如果想分别得到两种消化酶抑制活性高的多肽，就要通过2次超滤和2次纳滤，加工成本高，工艺烦琐。而通过一次超滤和一次纳滤得到的300～6 000 Da的多肽段同时包含了较高的α-淀粉酶抑制活性和脂肪酶抑制活性，且质量百分比达到81.65%，多肽得率为53.6%，具有工艺简单，消化酶的综合抑制活性高的优点，因此选用300～6 000 Da的多肽为本研究的火麻仁活性多肽。

表3 各段多肽的α-淀粉酶和脂肪酶抑制率表（多肽浓度15 mg·mL-1）

2.3 火麻仁活性多肽的减肥动物实验结果

动物实验表明（表4），与高热量组相比，同样摄入高热量饲料的火麻仁活性多肽大、小剂量组动物的脂肪体重比和体重增重率明显降低（P＜0.05或P＜0.01），大剂量组的脂肪体重比降低效果优于小剂量组。说明该多肽中的α-淀粉酶抑制肽和脂肪酶抑制肽通过抑制淀粉和脂肪的吸收减缓了肥胖模型动物的体重增长，也说明该火麻仁活性多肽可以抵抗胃蛋白酶和肠肽酶的降解，在小肠中保持一定的活性，可加工成减肥功能食品。此外，对比基础组和基础+多肽组的可以发现，健康动物在喂食常规饲料并摄入适量的火麻仁多肽后，体重增重率虽然比未摄入多肽的动物有所降低，但是并无显著差异，说明适量摄入该多肽对正常动物的体重等无明显影响。

表4 火麻仁活性多肽对小鼠体重增重率及脂肪体重比的影响表（）

表4 火麻仁活性多肽对小鼠体重增重率及脂肪体重比的影响表（）

注：*表示与模型组相比P＜0.05；**表示P＜0.01。

组别 数量 每只摄入总热量/kJ每只总摄食质量/g 体重增重率/% 脂肪/体重基础组 9 1 432.0 90 22.30±4.22* 2.39±0.40*基础+多肽组 9 1 432.0 90 19.97±5.34* 2.20±0.33*高热量组 8 1 719.5 90 28.56±5.71 3.66±0.46多肽大剂量组 9 1 719.5 90 14.48±3.85** 1.91±0.30**多肽小剂量组 9 1 719.5 90 16.10±4.10** 2.46±0.34*

3 结论

综上所述，脱脂火麻仁粕选用3.4310性蛋白酶+胃蛋白酶依次水解，可以得到具有抑制α-淀粉酶活性的火麻仁多肽，α-淀粉酶抑制率可以达到66.59%，但是第一阶段水解多肽得率只有34%～38%，因此本文将3.4310酶+胃蛋白酶水解液的离心沉淀物再用中性蛋白酶水解，可以获得具有脂肪酶抑制活性的多肽水解液，多肽得率在18%左右，第二阶段水解的适宜条件为温度50 ℃、时间120 min、pH值为7.5和加酶量5 000 u·g-1。将第一、第二阶段的酶解多肽的分离液合并后，经过膜分离得到的300～6 000 Da的混合多肽的α-淀粉酶抑制率为52.18%，脂肪酶抑制率为36.79%，该活性肽的得率为53.6%。动物实验表明，该活性肽对高热量模型小鼠的减肥效果好，各剂量组与模型组相比均有显著差异（P＜0.05），可开发为减肥功能食品。