单环刺螠体腔液抑菌特性研究

甘宏涛，刘统昊，丁子媛，姚海洋，崔 楠，孟 霄，徐国成，曹黎鑫，许星鸿

( 江苏海洋大学 海洋生命与水产学院，江苏 连云港 222005 )

单环刺螠(Urechisunicinctus)俗称海肠，为典型的滤食性海洋无脊椎动物，其体内缺乏T细胞和B细胞，主要依赖由体表黏液—体壁—体腔液组成的非特异性免疫系统对抗入侵的病原体，其体腔液是抵御病原菌侵染的主要成分。国内外关于单环刺螠的研究主要集中于繁殖发育[1-2]、人工育苗[3]、营养成分分析[4]、硫化物代谢[5]以及活性物质[6-7]等方面。据夏玉秀等[8]报道，单环刺螠体表黏液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等9种菌无明显抑制作用。关于其体腔液抑菌特性迄今尚未见报道。

目前有关海洋无脊椎动物体液和血淋巴细胞抑菌特性的报道多集中于节肢动物、软体动物和棘皮动物。Haug等[9]从蜘蛛蟹(Hyasaraneus)血细胞破碎液中提取到的活性物质对大肠杆菌(Escherichiacoli)、前毛弧菌(Vibrioanguillarum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和金黄色葡萄球菌具有抑菌性，并对谷氨酸棒状杆菌抑制效果最好；铠甲虾(Galatheastrigosa)和挪威龙虾(Nephropsnorvegicus)的血淋巴细胞破碎液上清液对柠檬扁球菌(Planococcuscitreus)具有显著抑制作用[10]；马氏珠母贝(Pinctadamartensii)的血液上清液对大肠杆菌和藤黄微球菌(Micrococcusluteus)具有明显抑制作用[11]。海胆Paracentrotuslividus的体腔液上清液和体腔细胞破碎液上清液对溶藻弧菌(V.alginolyticus)均具有抑菌活性[12]。然而，并非所有海洋无脊椎动物的体腔液或血液均具抑菌活性，有的甚至还能促进某些细菌的生长[13]。

笔者以牛津杯法和生长曲线抑制法检测单环刺螠的抑菌特性，并分析温度、盐度、饥饿和干露对其抑菌活性的影响，探讨单环刺螠体腔液对病原菌侵染和环境胁迫下的免疫应答，为单环刺螠的相关免疫学研究和健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验用单环刺螠购自连云港水产品市场，所选个体活力强且体表无损伤，体质量(18.03±1.35) g，体长(9.08±1.25) cm。暂养条件为盐度25，pH 8.0，水温(20±1) ℃，连续充气，日换水1次并投喂2次等比例混合的螺旋藻粉和海参开口饵料。

1.2 试验菌种

试验所用菌种为江苏海洋大学海洋经济动物资源实验室保存的菌种。包括6种革兰氏阴性菌：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、大肠杆菌、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、凡隆氏气单胞菌(A.veronii)和哈维氏弧菌(V.harveyi)；2种革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌(M.lysodeikticus)。菌种活化后，接入LB液体培养基，以转速180 r/min、28 ℃恒温振荡培养24 h，4 ℃冷藏备用，使用前将菌液调整至600 nm波长下光密度[D(600 nm)]为1.0。

1.3 单环刺螠体腔液提取物的制备

取单环刺螠用海水冲洗体表，滤纸吸干，从吻处剪开获取体腔液，混匀后，4 ℃，3000 r/min(离心半径13.5 cm，下同)离心20 min，取上清液作为体腔液上清液，-40 ℃冻存；将离心所得血细胞沉淀用3 mL无菌生理盐水重悬后，经超声波破碎仪(Biosafer650-92型)4 ℃破碎5 min，4 ℃，10 000 r/min离心30 min，取上清液作为体腔细胞破碎液上清液，-40 ℃冻存备用。

1.4 单环刺螠体腔液对8种细菌的抑制作用

1.4.1 牛津杯法

采用牛津杯法通过琼脂径向扩散来检测体腔液的直观抑菌效果，具体操作：在超净台中，当灭菌后的LB固体培养基冷却至约40 ℃，以V(菌悬液)∶V(培养基)=1∶100的比例接入已知菌悬液，将其混匀倒至无菌培养皿中，凝固后将牛津杯轻轻按入培养基，不可触底。用移液枪分别向杯孔中注入150 μL体腔液提取物或等量生理盐水，28 ℃培养24 h后测量抑菌圈并拍照。试验重复3次。

1.4.2 生长曲线抑制法

以生长曲线抑制法测定单环刺螠体腔液对8种细菌生长的影响，具体测定方法参考文献[14]。以生理盐水+菌悬液为对照组，试验重复3次。

1.5 环境因子对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

根据文献[15-17]得知单环刺螠对温度、盐度和干露时间的耐受范围分别为-4～35.77 ℃、13.8～35.9、0～72 h，分别设置试验组。

1.5.1 不同盐度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

盐度试验设置15、20、25、30、35共5个梯度，以曝气自来水与海水晶调节至相应盐度。每组设3个平行，每个平行随机选取10只单环刺螠，试验期间其他条件均同暂养期间。处理48 h后解剖取体腔液，制备体腔细胞破碎液上清液(方法见1.3)。取1.5 mL体腔细胞破碎液上清液与0.5 mL菌悬液(凡隆氏气单胞菌)混合，28 ℃孵育2 h，将混合液4 ℃，10 000 r/min离心30 min后，弃上清液，以300 μL无菌生理盐水重悬后接种至30 mL LB液体培养基中，每隔1 h吸取3 mL菌液，用分光光度计测定波长600 nm下吸光度，共取样6次。试验重复3次。

1.5.2 不同温度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

将温度组设置A和B 2个组，每组设置5个温度梯度：A组(4、8、12、16、20 ℃)、B组(22、26、30、34、38 ℃)。用生化培养箱(SPX-250B-Z型)调至对应温度，每个梯度设3个平行，每个平行随机选取10只单环刺螠。处理2 h后解剖取样。样品处理与测定方法同1.5.1。试验重复3次。

1.5.3 干露对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

将干露胁迫时间设置为2、4、6、8、10 h共5个时间段。每组设3个平行，每个平行随机选取10只单环刺螠。将单环刺螠放入底部铺上少量海水的托盘，暴露于空气中，处理相应时间后解剖取样。样品处理与测定方法同1.5.1。以生理盐水+菌悬液为对照组1，未干露组体腔细胞破碎液上清液+菌液为对照组2。试验重复3次。

1.5.4 饥饿对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

饥饿胁迫试验设置为1、2、3、4、5 d共5个梯度。胁迫期间除不投喂饵料外，其他条件同暂养，每组设置3个平行，每个平行随机选取10只单环刺螠。处理相应时间后解剖取样。样品处理方法同1.5.1。以生理盐水+菌液为对照组1，未饥饿组体腔细胞破碎液上清液+菌液为对照组2。试验重复3次。

1.6 数据分析

试验结果以“平均值±标准差”表示，使用SPSS 25.0进行单因子方差分析、LSD多重比较和Duncan检验。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 单环刺螠体腔液对8种细菌的牛津杯试验

牛津杯试验结果显示，单环刺螠体腔液上清液对鳗弧菌可观察到明显的抑菌圈，体腔细胞破碎液上清液可对凡隆氏气单胞菌、副溶血弧菌和鳗弧菌产生抑制作用，其抑菌圈大小依次为：鳗弧菌>副溶血弧菌>凡隆氏气单胞菌(图1)。体腔细胞破碎液上清液对鳗弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏气单胞菌的抑菌活性极显著高于体腔液上清液(P<0.01，n=3)(表1)。体腔液上清液和体腔细胞破碎液上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和溶壁微球菌等5种菌均未显示出抑菌活性。

图1 单环刺螠体腔液对8种细菌的牛津杯试验

表1 单环刺螠体腔液对8种细菌的抑菌圈直径(n=3)

2.2 单环刺螠体腔液对8种细菌生长的影响

生长曲线检测结果显示，与对照组(生理盐水+菌液)相比，在8种受试细菌中，体腔液上清液对鳗弧菌和副溶血弧菌有显著抑菌效果(P<0.05)，体腔细胞破碎液上清液对鳗弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏气单胞菌具有显著抑菌作用(P<0.05)(图2)。

图2 单环刺螠体腔液对8种细菌生长的影响

2.3 环境因子对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

2.3.1 不同盐度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

盐度对单环刺螠体腔液抑菌活性影响显著(图3)。盐度25组体腔细胞破碎液上清液抑菌活性最强，但与盐度20和盐度30两组的抑菌活性差异不显著。盐度15和35两组抑菌活性下降极显著(P<0.01)，且盐度15组的抑菌活性显著低于盐度35组(P<0.05)，表明低盐胁迫对体腔液抑菌活性影响更大。

图3 盐度对单环刺螠体腔细胞破碎液上清液抑菌活性的影响

2.3.2 不同温度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

当温度处于12～26 ℃时，单环刺螠体腔细胞破碎液上清液抑菌活性较强，且组间差异不显著(图4)。8 ℃试验组抑菌效果显著降低(P<0.05)；4 ℃试验组抑菌活性下降极显著(P<0.01)。30 ℃试验组抑菌活性显著下降(P<0.05)；当温度≥34 ℃，抑菌活性下降极显著(P<0.01)，并且个体开始出现死亡。

图4 温度对单环刺螠体腔细胞破碎液上清液抑菌活性的影响

2.3.3 干露胁迫对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

单环刺螠干露胁迫6 h以内，试验样品无异常表现，其体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性无显著性变化；干露时间8 h和10 h两组的试验样品体表黏液分泌增多、体壁收缩加剧，但并未出现个体死亡现象，其体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性显著下降(P<0.05)(图5)。

图5 干露胁迫对单环刺螠体腔细胞破碎液上清液抑菌活性的影响

2.3.4 饥饿胁迫对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

随着饥饿时间延长，单环刺螠体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性逐渐下降(图6)。饥饿1 d，抑菌活性有所降低但与对照组差异不显著；饥饿2～4 d，抑菌活性极显著下降(P<0.01)；饥饿5 d，体腔细胞破碎液上清液几乎没有抑菌活性，但处理期间未出现个体死亡。

图6 饥饿胁迫对单环刺螠体腔细胞破碎液上清液抑菌活性的影响

3 讨 论

3.1 单环刺螠体腔液不同组分的抑菌活性

在海洋无脊椎动物中，节肢动物门、软体动物门和棘皮动物门的类群具有重要经济意义，其相关免疫机制以及抑菌特性的报道亦较多。在中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[18]、铠甲虾[10]、紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)[19]和马氏珠母贝[11]的血淋巴细胞破碎液上清液中发现显著的抑菌特性，但其体腔液上清液的抑菌作用较弱；Tsvetnenko等[20]发现，天鹅龙虾(Panuliruscygnus)血淋巴中具有抑菌能力，其抑菌活性定位于血细胞中，血淋巴上清液的抑菌能力有限。本试验中，以嗜水气单胞菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、凡隆氏气单胞菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌等8种菌为受试菌，检测出单环刺螠体腔细胞破碎液上清液对鳗弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏气单胞菌具有明显抑菌作用，体腔液上清液对鳗弧菌和副溶血弧菌有显著抑菌效果，且体腔细胞破碎液上清液对鳗弧菌的抑菌圈显著大于体腔液上清液，表明体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性大于体腔液上清液，与上述研究结果相一致。

丛聪等[14]发现，仿刺参(Apostichopusjaponicus)体腔液上清液对溶壁微球菌具有抑制作用，而体腔细胞破碎液上清液对哈维氏弧菌等8种细菌均不具备抑菌能力，表明抑菌活性因种类而异。并非所有海洋无脊椎动物的体腔液或血液都具有抑菌作用，如Alabi等[13]发现，幼生期凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的血细胞破碎液上清液能显著促进大肠杆菌的生长。不同的抑菌因子和不同种类的细菌侵染会导致海洋无脊椎动物抑菌能力产生差异。

谭建[21]在仿刺参肠道中提取到一类由小分子多肽组成的抑菌成分，对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、大肠杆菌、鳗弧菌、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)、哈维氏弧菌均具有显著的抑菌效果；赵欢等[22]在单环刺螠肠道和体腔液混合源中获得一类小分子多肽，发现可在体外显著提高小鼠的非特异性免疫活性。本试验中，单环刺螠体腔细胞破碎液上清液较体腔液上清液表现出更强的抑菌能力，针对其生存环境较恶劣，却极少患病，结合本试验中单环刺螠体腔液抑菌结果，推测其体内具有一套稳定的抑菌机制，并且抑菌因子可能为多肽类，且主要存在于体腔细胞中。

3.2 盐度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

盐度变化直接影响水生无脊椎动物血细胞密度和相关免疫指标[23]。Zhao等[24]研究发现，凡纳滨对虾在低盐度胁迫下，其免疫应答会受到抑制；Joseph等[25]发现，低盐度(<15)和高盐度(>35)胁迫可引起斑节对虾(Penaeusmonodon)血淋巴代谢和免疫指标的改变，低盐胁迫下降趋势更明显。本试验中，单环刺螠体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性在盐度25达到最强，盐度20和盐度30两组次之，盐度15和盐度35两组的抑菌活性显著下降，以低盐胁迫影响更加显著，与前者研究结果一致。

朱晓莹等[26-27]研究了盐度对单环刺螠体腔液免疫指标的影响，盐度15和35下血细胞密度减小和免疫力显著下降，以低盐环境影响更为显著，与本试验抑菌活性结果类似。目前，已有不少学者[2,16-17,28]对单环刺螠盐度的耐受性展开了研究，其耐受盐度为13.8～35.9，适宜生长盐度为25～30。由此可见，在单环刺螠人工养殖过程中，要重视水体盐度的变化，尤其是暴雨导致水体盐度骤降，需及时调整，以保证其各项生理功能和免疫应答的稳定性，减少疾病暴发。

3.3 温度对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

单环刺螠属于变温动物，其体腔液的免疫指标及生理功能会直接受养殖水体温度的影响。本试验结果显示，单环刺螠体腔液抑菌活性对温度变化较为敏感，当温度为12～26 ℃时，体腔液抑菌活性保持较高水平，但温度低于12 ℃或超过26 ℃后，体腔液抑菌活性均显著下降。在已报道的黑唇鲍(Haliotisrubra)[29]、紫贻贝[30]和中华鳖(Trionyxsinensis)[31]中，温度骤变对其血液或体腔液的抑菌活性具有显著影响。李诺等[15]发现，当养殖水体温度超过32.5 ℃，单环刺螠成体开始出现死亡；可见温度不适宜不仅会对抑菌能力产生影响，其存活率也大大降低。因此在单环刺螠人工养殖中，要关注水温的变化，以控温设施或调节水体深度来保证适宜的水温条件。

3.4 干露胁迫对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

单环刺螠主要分布于我国黄渤海，在销售过程中需要进行运输。夏玉秀等[8,15]分别就单环刺螠在干露胁迫下的成体存活率以及体表黏液组成及抑菌特性的变化进行了研究，发现短时间的干露胁迫对以上方面并无显著影响。本试验中，当干露胁迫超过8 h，单环刺螠体腔液抑菌活性才会发生明显变化，亦表明单环刺螠具有较强的耐干露特性，因此短时间的无水无沙运输方式是可行的。

3.5 饥饿胁迫对单环刺螠体腔液抑菌活性的影响

在自然环境或长途运输中，单环刺螠可能会面临饥饿胁迫。本试验结果显示，饥饿2～4 d的单环刺螠体腔液抑菌活性即出现极显著下降，饥饿5 d后虽然仍然存活但体腔液已几乎没有抑菌活性。九孔鲍(H.diversicolor)在饥饿胁迫后其血液上清液对副溶血弧菌的抑菌能力显著下降[32]；虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、凡纳滨对虾和仿刺参经饥饿胁迫后，其相关免疫指标和生理功能均已发生显著变化[33-34]。我国水产养殖模式多以大规模高密度养殖为主，因此养殖密度过大或投饵不足，都会对养殖个体的免疫力有明显影响，使其抗病能力显著降低[35]。单环刺螠人工养殖尚处于初步探究阶段，养殖密度和投饵量还没有标准模式可以参考，有待于结合养殖中的机体免疫机能变化进行深入研究。

4 结 论

单环刺螠体腔细胞破碎液上清液的抑菌活性强于体腔液上清液，对鳗弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏气单胞菌具有显著抑制作用。在盐度20～30，温度12～26 ℃条件下，抑菌活性较强。低盐胁迫比高盐胁迫对抑菌活性影响更大。干露时间超过8 h或饥饿时间超过2 d，体腔液抑菌活性显著降低。