感染寨卡病毒后埃及伊蚊黄病毒NIRVS表达的检测*

刘 源 姜玉庭 贾 楠 张恒端 李春晓 邢 丹 郭晓霞 高 剑 赵彤言

(军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071)

埃及伊蚊Aedesaegypti又称黄热病蚊虫，能传播黄热病、登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病等多种疾病，广泛分布于世界各地的热带和亚热带地区(Eisenetal., 2013)。近年来，蚊媒病毒相关传染病的出现、复苏和扩散已经对公众健康造成威胁，而埃及伊蚊在疾病传播方面起重要作用(Lietal., 2017)。

寨卡病毒(ZIKV)为黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒 (Vasilakisetal., 2017)，最早于1947年在乌干达恒河猴体内首次分离出, 1952年首次从人体中检测出来(Dicketal., 1952)。2015年，寨卡病毒在美洲暴发流行后形成全球大规模流行态势(Zanlucaetal., 2015)。寨卡病毒的传播途径包括蚊媒传播、性传播、血液传播、母婴传播，其中带毒蚊媒叮咬是最主要的传播途径(Boormanetal., 1956; Foyetal., 2011; Besnardetal., 2014; Mussoetal., 2014; Calvetetal., 2016)。已有研究证实，埃及伊蚊是寨卡病毒的高效传播媒介(Lietal., 2012; Wongetal., 2013; Diagneetal., 2015; Chouin-Carneiroetal., 2016)。

RNA干扰(RNAi)途径是蚊媒体内主要抗病毒防御体系(Dingetal., 2007)，也是影响埃及伊蚊传播寨卡病毒媒介效能的因素之一。该途径主要包括3种RNA分子：小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)(Houéetal., 2019)。其中piRNA分子介导的抗病毒免疫通路称为piRNA通路(Ozataetal., 2019)。大多数物种基因组上存在一些离散的、可转录生成大量piRNA分子的基因位点，这些位点被称为piRNA簇(piRNA cluster)(Czechetal., 2018)，在果蝇及哺乳动物基因组中，piRNA分子主要来源于piRNA簇，并占总piRNA数量的90%以上(Aravinetal., 2006; Girardetal., 2006; Brenneckeetal., 2007)。Palatini等(2017)分析了22个蚊种基因组中非逆转录病毒的整合RNA病毒序列(non-retroviral integrated RNA virus sequences, NIRVS)(Crochuetal., 2004)特征，发现伊蚊基因组中NIRVS数量最多，且主要分布在piRNA簇区域。目前注释的piRNA簇序列虽然仅占埃及伊蚊基因组序列的1.24%，然而其44%的NIRVS均分布在piRNA簇中(Arensburgeretal., 2011)。随后，诸多研究证明，NIRVS可以作为转录模板生成piRNA分子，通过RNAi途径参与蚊虫抗病毒作用(Goietal., 2016; Suzukietal., 2017; Suzukietal., 2020)。

本文基于小RNA测序和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，筛选出与寨卡病毒感染相关的黄病毒NIRVS，探讨埃及伊蚊在感染寨卡病毒(ZIKV)后，黄病毒NIRVS表达量相比于对照组的变化，比较两种方法检测结果的差异，为后续选择黄病毒NIRVS的检测方法提供思路。

1 材料与方法

1.1 蚊株

埃及伊蚊于2019年9月采于云南省西双版纳自治州勐海县(地理坐标：21°57'48"N, 100°27'34"E)，采集后于实验室适宜环境中稳定饲养并传代。饲养温度27 ℃～29 ℃，相对湿度70%～80%，光照时长与黑暗时长之比为14 h：10 h，饲喂8%蔗糖水。

1.2 病毒株

寨卡病毒为ZIKV SZ01株，由微生物流行病研究所病毒学研究室提供，实验前已在白纹伊蚊C6/36细胞中传代培养6代，保存于-80 ℃冰箱。

1.3 主要仪器与试剂

1.3.1主要仪器：荧光定量PCR仪(appliedbiosystems，型号：QuantStudio 7 Flex)、医学昆虫供血器 ( 军事医学科学院实验仪器厂)、 96孔板离心机(PRIMA，型号: PMC2500)、高速冷冻离心机(Thermo Scientific，型号：50144036)、台式超低温冷冻研磨仪(北京赫得公司，型号：京·N9548R)。

1.3.2主要试剂：RNAiso Plus(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：9109)、无水乙醇(国药集团，货号：10009218)、三氯甲烷(国药集团，货号：10006818)、异丙醇(国药集团，货号：80109218)、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR047A)、PerfectStart®Green qPCR Supermix(北京全式金生物技术有限公司，货号：AQ601)、1%肝素钠抗凝血剂(Biotopped，货号：HO393)、FBS胎牛血清(Gibco，货号：10099-141C)、RPMI Medium 1640(Gibco，货号：8121373)。

1.4 蚊虫经口感染实验

ZIKV感染组：将病毒原液和鼠血1∶1混合成病毒血餐，病毒血餐的滴度为1.1×106PFU/mL， 加入200 μL FBS混合均匀；血餐组：将1640培养基和鼠血1∶1混合成对照组血餐，加入200 μL FBS混合均匀。糖水组：自蚊虫羽化后，始终用8%的蔗糖水饲喂，未经其他处理，为空白对照组。取6 mL病毒血餐或对照组血餐放入多功能吸血昆虫供血器的血皿中，轻轻展开parafilm封口膜，以此模拟皮肤封住血皿口，加热血餐至37 ℃；将血皿放置于断糖水24 h的蚊笼中，蚊虫吸血1 h后取出血皿，挑取饱血雌蚊，继续用8%的蔗糖水饲喂。

1.5 蚊虫解剖

在喂食血餐后特定时间点用吸蚊器吸取埃及伊蚊雌蚊，将蚊虫麻醉后置于冰上的培养皿中，去除蚊虫翅膀及六足，解剖得到蚊虫中肠，将中肠组织装入含RNA保存液的EP管中，用于后续RNA提取。

1.6 高通量测序与分析

喂食血餐后第7天，ZIKV感染组、对照组和糖水组埃及伊蚊各取100只解剖取中肠，同组中肠组织合并为1个pool，送华大基因公司完成small RNA提取、建库和测序。测序结果过滤掉低质量值reads和接头污染，裁剪接头后再进行后续分析。首先用Bowtie软件将reads比对到埃及伊蚊基因组生成SAM文件，再用samtools生成bam索引文件，最后统计比对到不同NIRVS的reads数，计算FPKM值，用R语言计算差异倍数、FDR值和画热图。

1.7 RNA提取

提取吸食血餐后第4天(dpi 4)、第7天(dpi 7)、第10天(dpi 10)感染组与对照组各30只埃及伊蚊中肠的总RNA，用于后续荧光定量PCR检测。

1.8 引物设计

根据黄病毒NIRVS在基因组上的坐标获得完整序列，使用primer premier 5软件设计扩增引物如表1所示，其中RPS6基因作为内部参照物同时检测。

表1 用于RT-qPCR检测的引物序列

1.9 RT-qPCR检测黄病毒NIRVS

使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒，将RNA按照如下两步反转录为cDNA：步骤一反应体系：5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μL；gDNA Eraser，1.0 μL；Total RNA， 1.0 μL； RNase Free dH2O，补足 10 μL。反应程序：42 ℃，2 min；4 ℃保存。步骤二反应体系：步骤一的反应液，10.0 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL；RT Primer Mix，1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)，4.0 μL；RNase Free dH2O，4.0 μL；合计20 μL。反应程序：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存。

使用全式金荧光定量PCR检测试剂盒(染料法)，以cDNA为模板进行RNA定量检测。反应体系：2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix，10.0 μL；Forward Primer(10 μm)，0.4 μL；Reverse Primer(10 μm)，0.4 μL；Passive Reference Dye(50×)，0.4 μL；cDNA模板，2.0 μL；Nuclease-free Water，补足至20 μL。反应程序：94 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40个循环。

1.10 统计方法

ZIKV感染组与对照组间黄病毒NIRVS表达水平比较用曼—惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验，统计软件为SPSS 26.0。

2 结果

2.1 感染ZIKV埃及伊蚊中肠组织小RNA测序

对ZIKV感染第7天的埃及伊蚊中肠组织进行小RNA高通量测序，并以血餐喂食组和糖水喂食组作为对照。生物信息学分析显示，结果有6个黄病毒NIRVS(AeFlavi53、AeFlavi34B、AeFlavi31、AeFlavi4A、AeFlavi32、AeFlavi83)和9个棒状病毒NIRVS(AaRha33、AaRha61、AaRha80、AaRha91、AaRha100、AaRha139、AaRha142、AaRha144和AaRha163)在感染、未感染寨卡病毒的样本间的表达量存在显著的差异(图1)。由于ZIKV属于黄病毒属，故挑选6个黄病毒NIRVS用于后续RT-qPCR验证。

图1 埃及伊蚊黄病毒NIRVS表达差异热图

2.2 RT-qPCR检测

针对筛选的6个NIRVS基因设计定量PCR引物，对ZIKV感染第4、7、10天的中肠组织总RNA进行两步法RT-qPCR检测，结果表明：在所选的3个时间点中，共有4个黄病毒NIRVS表达有统计学差异。感染后第4天，AeFlavi53、AeFlavi34B和AeFlavi4A表达均上调，分别上调了2.2、2.1和1.8倍；感染后第7天，AeFlavi53表达上调1.6倍；感染后第10天，AeFlavi 34B、AeFlavi 31和AeFlavi 4A表达均下调，分别下调0.6、0.7、0.7倍(图2)。其中AeFlavi53在感染第4、7天均上调，AeFlavi34B和AeFlavi4A虽然在感染第4、10天表达均有差异，但表达调控方向不一致(图2，表2)。

表2 两种方法检测结果比较

图2 荧光定量PCR检测结果

2.3 小RNA测序结果与RT-qPCR结果的比较

ZIKV感染第7天小RNA测序结果显示埃及伊蚊中肠组织中黄病毒NIRVS片段AeFlavi53和AeFlavi4A表达上调，其余4种黄病毒NIRVS表达上调，但RT-qPCR结果显示仅AeFlavi53上调(表2)。虽然RT-qPCR结果显示感染第10天的AeFlavi34B、AeFlavi31和感染第4天的AeFlavi4A调控方向与小RNA测序结果一致，但两种方法检测的样本来源于不同感染天数，且RT-qPCR结果显示不同感染天数6种黄病毒NIRVS在感染ZIKV后调控方向有很大的差异。

3 讨论

蚊媒病毒与蚊虫宿主在长期共同演化过程中，部分RNA病毒序列以DNA的形式插入了蚊虫基因组中，这些片段被称为内源性病毒片段(EVEs)(Aiewsakunetal., 2015)，若片段来源于非逆转录RNA病毒，则被称为非逆转录病毒的整合RNA病毒序列(NIRVS)。埃及伊蚊基因组中超过一半的NIRVS存在于piRNA簇中，并能转录产生piRNA(Palatinietal., 2017)。有研究认为NIRVS可能参与了蚊虫的抗病毒免疫(Geukingetal., 2009)，并猜测NIRVS的免疫作用与 RNAi介导的蚊虫先天免疫系统有关(Goietal., 2016)。更有研究表明埃及伊蚊基因组中来源于细胞融合病毒(CFAV)的NIRVS通过转录产生piRNA抑制卵巢中CFAV的复制，证实了NIRVS与piRNA途径的紧密联系及抗病毒作用(Suzukietal., 2020)。ZIKV属于黄病毒科黄病毒属，与埃及伊蚊基因组中黄病毒NIRVS有一定的同源性，黄病毒NIRVS转录的piRNA可能通过与ZIKV的同源片段结合发挥RNAi效应，从而发挥抗ZIKV感染效应。本研究通过小RNA高通量测序筛选出ZIKV感染后埃及伊蚊中肠表达量存在差异的EVEs共15个，包含6个黄病毒NIRVS和9个棒状病毒NIRVS，证实ZIKV感染能影响相应黄病毒NIRVS的表达。

黄病毒NIRVS转录产生piRNA的生物学过程为：首先在细胞核内以黄病毒NIRVS为模板转录出长链piRNA前体，piRNA前体进入细胞质后在PIWI5和Ago3蛋白的“乒乓循环”作用下剪切为～28 nt的成熟piRNA (Kumaretal., 2018; Varjaketal., 2018)，成熟的短片段piRNA通过与病毒基因组RNA互补结合发挥RNA干扰作用(Varjaketal., 2017)。要准确测量piRNA的表达量需要通过高通量测序的方法，但该方法需要从蚊虫总RNA中分离小RNA，再通过建库、测序和分析的复杂步骤才能得到最终结果，过程复杂、耗时长、成本高。成熟piRNA是由长链piRNA前体经Piwi蛋白和Ago蛋白剪切加工后生成，因此针对前面筛选的6个黄病毒NIRVS序列设计了定量PCR引物，通过两步法RT-qPCR检测这6个片段转录的长链piRNA前体水平。

RT-qPCR结果显示在不同感染天数，6种黄病毒NIRVS在感染ZIKV后调控方向有很大的差异，仅AeFlavi53在感染第4和7天表达上调，其余片段调控方向不一致或表达量在感染组与对照组间无统计学差异。并且在感染后第7天，仅AeFlavi53的定量结果与小RNA测序结果一致，其余5种片段表达量无显著差异。分析产生这种不一致现象的原因是，qPCR检测针对的是长链piRNA前体，而小RNA测序是针对成熟的piRNA短片段，piRNA产生的生物学过程复杂，其表达调控可能针对不同的酶促反应阶段。比如，若调节针对转录环节，两者表达量应为共同消长，若调节针对“乒乓循环”的剪切环节，两者含量则为此消彼长。正是这种调控的复杂性，导致中间体的长链piRNA前体的含量很不稳定，不适宜作为RT-qPCR的扩增对象。后续可根据高通量测序结果，筛选丰度较高的成熟短片段piRNA，利用茎环RT-qPCR进行进一步验证。

在既往研究中，研究人员均以小RNA测序结合生物信息学分析评判匹配到病毒基因组或蚊虫基因组NIRVS的26～31 nt reads数判断piRNA的丰度(Tassettoetal., 2019; Suzukietal., 2020)，虽然该方法耗时长、成本高，但本研究设想的针对piRNA前体长链序列的RT-qPCR检测策略也被证明不适用，因此要准确判断NIRVS表达的piRNA水平，小RNA测序是目前唯一适用的方法。