旋毛虫预感染对小鼠急性脊髓损伤炎症反应的抑制作用*

徐常艳 王小莉 万 晨 杨浩宇 邱 禹 许梦梦 吴宜修 常雪莲 袁 圆 李徽徽 褚 亮 杨小迪

(1.蚌埠医学院基础医学院，安徽蚌埠 233030；2.感染与免疫安徽省重点实验室，安徽蚌埠 233030；3.蚌埠医学院第二附属医院，安徽蚌埠 233030)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是指由于各种原因导致的脊髓完全或不完全伤害，最终造成病人完全或不完全性瘫痪(Eftekharpouretal., 2008)。SCI的病理过程分为急性期(0～7 d)、 亚急性期(7～14 d)和慢性期(>14 d)(Badhiwalaetal., 2021)。SCI病理进程分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤是外力直接或间接作用于脊髓所造成的机械性损伤(Kasinathanetal., 2015)，而继发性损伤则是指脊髓组织对创伤所产生的包括局部水肿、缺血、缺氧、自由基积聚和炎症反应等一系列细胞和分子机制的改变(Okadaetal., 2018)。SCI后，炎症反应相关小胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、抗体和细胞因子等对SCI病理进展产生重要影响(Rustetal., 2017)，也影响着继发性损伤进程和损伤后的功能恢复程度，因此，减轻继发性损伤引起的炎症反应成为SCI研究的重点之一。

旋毛虫Trichinellaspiralis作为一种可在人体长期寄生的组织内线虫，可通过其排泄—分泌产物作用，抑制过度的免疫应答及剧烈的炎症反应，修复虫体在寄生过程中对机体造成的损伤，营造利于其长时间寄生的微环境(Whelanetal., 2012; Steinfelderetal., 2016; Coakleyetal., 2020)。有研究表明旋毛虫感染可改善呼吸道合胞病毒诱导的炎症性反应(Chuetal., 2020)，本课题组前期亦证实，旋毛虫及其衍生蛋白可显著缓解小鼠急性溃疡性结肠炎(Yangetal., 2014)、哮喘(Sunetal., 2019)、脓毒症(李徽徽等, 2016; 杨小迪等, 2016; Lietal., 2021)，但旋毛虫及其衍生蛋白是否对SCI有改善作用未见报道。本研究采用旋毛虫预感染对急性SCI小鼠进行干预，检测其预防效果并初步分析其作用机制，旨在为蠕虫或虫源性分子治疗和预防SCI提供实验基础及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及虫株

SPF级C57BL/6小鼠(雌性，6～8周龄)，购自常州卡文斯实验动物有限公司(SCXK(苏)2016-0010)。雌性ICR小鼠，20～23 g/只，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司。(22±2)℃常温环境，自由饮食，饲养于蚌埠医学院实验动物中心。河南猪源旋毛虫株由郑州大学基础医学院崔晶教授惠赠，本实验室经ICR小鼠传代保种。本研究获得蚌埠医学院伦理审查委员会批准(伦理编号：伦动科批字[2021]第324号)。

1.2 主要试剂与材料

胃蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司)、明胶(Sigma)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp 公司)；Trizol (Thermo Fisher)；苏木精伊红染色试剂盒(碧云天)；4%多聚甲醛、石蜡和二甲苯(麦克林公司)；ELISA试剂盒购自上海达科为公司(IL-6、IL-10、TNF-α)和ABclonal公司(TGF-β)；逆转录试剂盒(Thermo scientific)、实时荧光定量PCR试剂盒(Sangon Biotech)。

1.3 脊髓损伤动物造模

C57BL/6小鼠腹腔注射5%水合氯醛，充分麻醉后，切开皮肤和肌肉，暴露胸段棘突，咬除T9的椎板，暴露脊髓，通过夹持T7和T11棘突来稳定脊柱，用直径1.3 mm的钻头以合适的力度建立中度SCI模型。SCI后，止血、缝合各层组织(Chenetal., 2020)。假手术小鼠只打开椎板，不损伤脊膜及脊髓。术后小鼠置于暖光灯下复苏，苏醒后Basso小鼠评分(Basso mouse scale, BMS)标准评分0分，判断为建模成功。术后分笼饲养，每天早、晚挤压膀胱协助排尿两次，连续7 d给予小鼠皮下注射青霉素预防感染。

1.4 旋毛虫肌幼虫分离及实验分组

取经旋毛虫感染的ICR小鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，去除小鼠的头部、皮毛、内脏和脂肪，分离出剩余肌肉后，用胃蛋白酶消化法消化，收集肌幼虫，并混悬于4%明胶，定量计数后，以350条肌幼虫经口灌胃感染相应组别实验鼠。将C57BL/6小鼠随机分为4组：A组为假手术组、B组为旋毛虫预感染后14 d+假手术组、C组为脊髓损伤组、D组为旋毛虫预感染后14 d+脊髓损伤组。

1.5 后肢运动功能检测

分别于术后第7天，采用详细的BMS标准，在旷场中对各组小鼠后肢功能进行评估。把小鼠放置在旷场中，提前熟悉环境10 min，观察分析后打分，BMS是10分制(0～9)，0分代表后肢完全瘫痪，9分代表后肢运动功能正常，评分越高则表示小鼠后肢功能越健全(Bassoetal., 2006)。评分均采用双人双盲独立观察与记录，实验重复3次，取平均值。

1.6 样本准备

1.6.1脊髓的提取：各组小鼠于术后7 d取材，小鼠乙醚麻醉后断头处死，剪开背部皮肤和肌肉，自损伤区向头侧和尾侧各打开2～3个锥板，以损伤区为中心取1 cm脊髓置于无RNA酶的冻存管中，-80 ℃保存。

1.6.2血清的分离：各组小鼠于术后 7 d 实施眼球采血，将采集的血液置于洁净干燥的1.5 mL离心管内，待其自然凝固后，分离血清。将分离的血清分装于无菌 EP 管内，置于-80℃保存。

1.7 脊髓组织HE染色

经4%多聚甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，行HE染色，在光学显微镜下观察脊髓组织病理损伤程度，在切片上随机选择3个以上相同大小的视野，用image pro plus 6软件计数HE染色切片中炎性细胞的数量(cells/mm2)，按炎性细胞数/组织面积求平均值。

1.8 脊髓组织总RNA提取、反转录和Real-time PCR检测

脊髓总RNA提取依据试剂盒说明书操作，引物逆转录后，通过RT-PCR检测各组小鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA的相对表达量。使用β-actin作为管家基因，所有引物如表1所示，采用20 μL体系(SYBR buffer 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL)进行RT-PCR扩增，反应条件为95℃3 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃15 s，45个循环。

表1 引物序列信息

1.9 ELISA检测血清炎症因子

按ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组小鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β水平。酶标仪检测450 nm处吸光度值，并计算各因子含量。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 旋毛虫预感染对急性脊髓损伤小鼠运动功能的影响

A和B组小鼠BMS行为学评分均为(9.00±0.00)分，SCI造模后第7天，C、D组小鼠BMS评分的平均分分别为(0.65±0.23)和(1.40±0.35)分。4组小鼠BMS评分差异有统计学意义(P<0.05)；与A组小鼠相比，C组小鼠 BMS 评分明显降低(P均 <0.05)；D组小鼠BMS评分高于C组小鼠(P<0.05)，后肢症状明显减轻(图1)。

图1 各组小鼠BMS评分

2.2 旋毛虫预感染对急性脊髓损伤小鼠组织病理变化的影响

术后7 d，A和B组小鼠脊髓组织结构完整，无明显炎症细胞浸润现象。C组小鼠脊髓组织结构明显损伤，出现脊髓充血、水肿等现象，侧索、背侧及中央灰质脊髓空洞增大，炎症细胞浸润增多。在旋毛虫预感染后，D组小鼠与C组相比，脊髓组织病理损伤得到改善，背侧白质及中央灰质组织破坏程度减小，炎症细胞浸润得到抑制(P<0.05)(图2)。

图2 各组小鼠脊髓组织病理学改变(HE染色)

2.3 旋毛虫预感染对小鼠急性脊髓损伤组织中炎症因子基因表达的影响

利用RT-PCR检测脊髓组织中促炎因子IL-6和TNF-α的mRNA的表达情况，结果显示：SCI组分别为(1.36 ± 0.09)和(1.88 ± 0.17)，较假手术组的(0.99 ± 0.05)和(1.01 ± 0.05)明显升高(P<0.05)。经旋毛虫预感染干预后，T.spiralis+SCI组上述两种促炎因子分别为(0.49 ± 0.12)和(0.69 ± 0.13)，较SCI组明显降低(P<0.05)。检测脊髓中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β mRNA的表达情况，结果显示：假手术组和SCI组的IL-10分别为(1.01 ± 0.09)和(1.06 ± 0.12)，两者比较差异无统计学意义(P> 0.05)；SCI组的TGF-β为(3.26 ± 0.42)，较假手术组(1.02 ± 0.08)显著升高(P<0.05)。经旋毛虫预感染干预后，T.spiralis+ SCI组IL-10和TGF-β分别为(1.57 ± 0.14)和(4.55 ± 0.28)，较SCI组明显升高(P<0.05)(图3)。

图3 各组小鼠脊髓组织中炎症因子mRNA的表达

2.4 旋毛虫预感染对急性脊髓损伤小鼠血清中炎症因子的影响

利用ELISA检测血清中促炎因子IL-6和TNF-α的结果显示：SCI组分别为(36.39 ± 3.32)和(90.41 ± 5.84)pg/mL，较假手术组的(23.00 ± 2.68)和(47.03 ± 1.89)pg/mL显著升高(P<0.05)。经旋毛虫预感染干预后，T.spiralis+SCI组上述两种促炎因子分别为(22.45 ± 1.82)和(43.83 ± 4.19)pg/mL，较SCI组明显降低(P<0.05)。检测血清中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的结果显示：假手术组和SCI组的IL-10分别为(28.08 ± 1.06)和(28.41 ± 1.08)pg/mL，两者比较差异无统计学意义(P> 0.05)，假手术组和SCI组的TGF-β分别为(21 984.56 ± 677.66)和(23 191.73 ± 783.52)pg/mL，两者比较差异无统计学意义(P> 0.05)。经旋毛虫预感染干预后，T.spiralis+SCI组上述两种抗炎细胞因子分别为(32.80 ± 2.18)和(35 189.79 ± 1 296.04)pg/mL，较SCI组明显升高(P<0.05)(图4)。

图4 各组小鼠血清中炎症因子的水平

3 讨论

SCI是一个致残率高、功能恢复差的疾病(Campagnoloetal., 2000; Wuetal., 2009)，可严重影响患者的生命健康和生活质量，给患者家庭以及社会造成沉重的经济负担(马海萍等, 2013)。目前急性SCI主要采用外科减压手术、神经营养、激素治疗及康复干预等临床综合治疗，但由于脊髓损伤后其神经再生能力弱,修复受损脊髓组织并使其实现功能正常化仍是目前医学难题，其治疗效果并不理想(冯浩铭等, 2021; 赵兴昌等, 2022)。因此，探索新型治疗药物或方法已成为脊柱外科的研究热点之一。多项研究表明，旋毛虫及其衍生蛋白可通过诱导调节性T细胞增殖及巨噬细胞极化，降低促炎细胞因子释放，促进抑炎因子分泌，显著改善哮喘、炎症性肠炎和实验性变态反应性脑脊髓炎等疾病症状(Baietal., 2012; 丁忆晗等, 2016; Kangetal., 2019)。本研究通过旋毛虫预感染观察其对小鼠急性SCI修复效果，发现旋毛虫预感染干预后SCI小鼠行为学BMS评分明显升高，脊髓组织病理损伤有所改善，表明旋毛虫预感染对小鼠急性SCI具有保护作用，这对于进一步研发旋毛虫及其衍生物用于SCI治疗提供了新思路。

脊髓损伤后外源性和内源性有害物质可通过血脑屏障进入中枢神经系统，局部和全身炎症因子变化不仅可预测SCI的进展，对SCI康复预后同样至关重要。IL-6可参与调节和刺激免疫细胞的生长，TNF-α是一种主要由小胶质细胞表达的促炎因子，两者被认为是SCI后潜在的炎症反应标记物(闵令霞等, 2021)。IL-10主要表达在单核细胞和调节性T细胞中，是重要的炎症抑制因子。而TGF-β可参与Foxp3+调节性T细胞和Th17细胞的免疫调节作用(郑晶晶等, 2012)。本研究分析了IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β在局部脊髓组织和血清中的表达水平，结果显示旋毛虫预感染对于正常小鼠几乎无影响；与空白对照组相比，SCI造模小鼠脊髓组织和血清中促炎因子IL-6、TNF-α表达水平均升高，在血清中抑炎因子IL-10、TGF-β水平无明显改变，表明SCI后炎症细胞能分泌较多IL-6、TNF-α等，而IL-10、TGF-β等表达较少，支持了在SCI急性期促炎因子占主导地位，而抑炎因子表达较低，这也是导致SCI继发性病理损伤的重要机制(Sunetal., 2016; Ahmedetal., 2018)。本研究发现在旋毛虫感染干预后，与SCI组比较，脊髓局部和血清中IL-6和TNF-α水平明显下降，IL-10和TGF-β水平显著升高。结合行为学变化和病理组织改变，提示旋毛虫预感染调控了小鼠SCI急性期炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的产生水平，改善了损伤脊髓炎症微环境，为SCI后修复创造了有利条件。

研究表明，在旋毛虫感染后，不仅能引起宿主Th2型免疫应答，同时也有Th1型免疫应答的参与，是细胞免疫与体液免疫共同作用的结果，其可进一步调控机体炎症因子的表达(苟强, 2014)。炎症因子是重要的免疫调节介质，SCI后促炎因子和抗炎因子的表达差异可能是损伤区炎症反应扩大，进一步造成脊髓继发免疫损伤的重要因素。适时局部或系统地调节不同炎症因子的表达，进而调节机体免疫反应，对于减小继发损伤促进SCI的修复有重要作用(Ferbertetal., 2017)。本研究表明旋毛虫预感染可通过调控炎症因子水平，对小鼠SCI急性期发挥保护作用，提示了旋毛虫及其衍生蛋白具有治疗炎症性疾病的潜力。鉴于直接用旋毛虫治疗疾病具有安全性问题(陈玉莹等, 2021)，旋毛虫来源的抗炎活性分子的筛选和验证仍有待于进一步探索。