穗花杉双黄酮对骨肉瘤细胞增殖及周期相关蛋白的影响

李正华,纪 涛,任建政,范跃星,陈小龙

(1.武警陕西省总队医院,陕西 西安 710054;2.武警山西省总队医院,山西 太原 030006;3.陕西省人民医院,陕西 西安710068)

骨肉瘤作为一种原发性恶性骨肿瘤，主要发病于青少年[1]，且在青少年中，发病率呈逐年上升趋势，该疾病严重影响患者的正常生活甚至生命安全[2]。目前，放疗、化疗、手术切除等方法一般较多地用于临床对骨肉瘤患者的治疗，这些方法仅仅某种程度上延缓病情进展，但无法根治转移性或复发性骨肉瘤患者[3-4]。因此，临床上急切需要新的治疗骨肉瘤的方法和药物。研究[5]显示，穗花杉双黄酮(Amentoflame，AF)具有调节凋亡信号通路、清除自由基、抗炎和抗氧化应激等功能，除此之外，文献[6-8]报道AF明显抑制肺腺癌、乳腺癌、胃癌细胞的增殖。但AF抑制骨肉瘤细胞增殖的分子机制尚不清楚。本实验通过CCK-8实验，细胞周期实验，Real time PCR及Western blot实验探究AF抑制骨肉瘤细胞增殖及其信号通路，为临床骨肉瘤的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 骨肉瘤细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自美国康宁公司，AF购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%,AF由 DMSO 溶解。流式细胞仪购于美国BD Pharmingen 公司，细胞周期试剂盒购于美国BD公司，Cyclin D1、p21、β-catenin和GAPDH抗体均购于美国Cell Signal Technolgy公司，CCK-8试剂购于上海酶联生物，全自动酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司(Bio Tek)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：将细胞接种在含有DMEM完全培养基的5% CO2培养箱中，培养基每3 d更换1次，当细胞接近铺满瓶底时，根据后续实验要求，对细胞进行处理。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力：实验分为0、25、50、75、125 μmol/L组，每孔接种吸取4×103个骨肉瘤细胞，24 h后，加入20 μl CCK-8反应液，继续孵育4 h，在酶标仪波长为490 nm时，测定各孔吸光度(吸光度代表细胞活力)，并进行统计学分析。

1.2.3 细胞周期检测：向6 孔细胞板加入2 ml×105个/ml的骨肉瘤细胞悬液，次日，实验分为对照组和AF(75 μmol/L AF)组，培养24 h后，收集细胞。将PBS洗涤3 次后的细胞进行染色后，上机检测细胞周期。

1.2.4 Western blot检测增殖相关蛋白表达：细胞处理方法和收获细胞方法与1.2.3相同,BCA法用于总蛋白的浓度，将蛋白和1× loading buffer 1∶1混匀，每孔上样20 μg，进行SDS-PAGE 电泳,之后用5%脱脂奶粉封闭2 h。将膜放入配制好的Cyclin D1(1∶1000)、β-catenin(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)和p21(1∶1000)一抗稀释液，将膜放入4 ℃孵育过夜，次日，用PBS洗膜3次，放入稀释的 HRP 标记山羊抗兔 IgG稀释液(1∶3000)并在室温下孵育 1 h，GAPDH作为内参。使用ECL Western(Thermo Fisher Scientific,Inc.)记录并分析染色蛋白条带[Image Lab(图像处理软件)V4.0]。

1.2.5 Real time PCR法检测增殖相关基因表达：细胞处理方法和获取与1.2.3相同，收集细胞，以总RNA 为模板合成cDNA,配制含有20 μl的反应体系,进行PCR反应。采用2-ΔΔCt法分析各基因相对表达量,各引物序列见表1。

表1 PCR基因引物序列相关信息

2 结 果

2.1 AF抑制骨肉瘤细胞活力 见图1。25、50 μmol/L的AF对骨肉瘤细胞吸光度值没有显著作用，75、125 μmol/L AF显著抑制骨肉瘤细胞吸光度值，与25、50 μmol/L AF比较差异有统计学意义(P<0.05)。本研究中75 μmol/L(AF组)是对骨肉瘤细胞具有抑制作用的最适宜浓度。

注：与25、50 μmol/L AF比较，*P<0.05

2.2 AF抑制骨肉瘤细胞从G1向S期过渡 见表2。与对照组(0 μmol/L)相比，AF组中，处于G0/G1期细胞百分比显著增加(P<0.05)，处于S期细胞百分比显著减少(P<0.05)。

表2 两组细胞周期分布比较(%)

2.3 AF抑制骨肉瘤细胞β-catenin核转录以及增殖相关蛋白和 mRNA表达 对照组中，β-catenin(绿色)的表达主要集中在细胞核，AF组中，β-catenin(绿色)的表达主要集中在细胞质，免疫荧光实验结果表明，相比对照组，AF显著抑制β-catenin(绿色)在骨肉瘤细胞核中的表达水平(图2A)。与对照组相比，AF显著抑制β-catenin蛋白表达水平，上调p21蛋白表达水平(均P<0.05)(图2B、C)。相比对照组，AF显著下调β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达、促进p21 mRNA表达(均P< 0.05)(图3)。

A:免疫荧光法检测β-catenin在细胞核表达水平；B:Western blot 检测β-catenin蛋白表达水平;C：骨肉瘤细胞中β-catenin蛋白表达水平柱状分析图(与对照组比较，*P<0.05)

注：Real time PCR法检测Cyclin D1(A)、p21(B)和β-catenin(C)mRNA表达水平(与对照组比较，*P<0.05)

3 讨 论

骨肉瘤一般发生于长骨的干骺端，具有发病率高、恶性程度高、发展迅速、转移率高、预后极差的特点[9-10]。目前，手术联合化疗方法较多地用于临床治疗原位骨肉瘤，但是，患者的治愈率低和复发程度高[11]，因此，寻求新的有效的治疗方案极为迫切。

本研究中，CCK-8 结果证实浓度为75 μmol/L的AF能够抑制骨肉瘤细胞的增殖。流式细胞周期实验进一步证实75 μmol/L AF可以显著抑制骨肉瘤细胞从G1期向S期过渡。免疫荧光、Western blot和Real time PCR实验证实AF显著抑制β-catenin的核表达，进而抑制周期蛋白Cyclin D1，促进p21表达，最终抑制细胞周期和增殖。

AF作为黄酮类中药单体，是一种卷柏提取物，文献[12-14]报道AF具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用,AF 通过干扰微管动力学和诱发DNA损伤引发SKOV3细胞分裂停滞在G2期。最新研究[15]表明，AF可以通过诱发人神经胶质瘤中的自噬依赖性铁死亡进而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。

在肿瘤的发展和形成中，Wnt/β-catenin信号通路发挥着重要的作用，参与肿瘤细胞的凋亡和增殖。作为Wnt/β-catenin 信号通路的关键调控蛋白，β-catenin在肿瘤中表达上调[16]，并且在各类细胞中起着粘连并传递信号的作用[17]，文献[18]报道，β-catenin的表达与致癌活性有关。β-catenin作为一种典型的粘连蛋白，是经典的Wnt信号重要的转录因子，在各类细胞中起着粘连并传递信号的作用[19]。Cyclin D1在调节细胞周期进程中起着至关重要的作用，Lin等[20]发现了一个完美的T细胞因子4(Tcf4)结合位点(CTTGATC)，该位点位于Cyclin D1启动子区域中的核苷酸(-80和-73之间)，该结论提示 β-catenin/Tcf4途径可能参与了对T细胞因子4的调控下 Cyclin D1表达。文献[21]报道在乳腺癌细胞系中，β-catenin/Tcf4途径参与细胞 Cyclin D1启动子的激活。Cyclin D1和p21，是细胞周期调控极为重要的调节因子，Cyclin D1主要参与细胞周期的基因突变和随后细胞周期G1/S期的转变[22]。p21 作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)家族成员之一，对CDK的抑制会在细胞周期的G1和G2阶段触发细胞周期停滞[23]，β-catenin是黏附连接的关键成员，位于正常细胞膜胞质侧的黏附复合物上,在病理条件下，由于药物或者细胞因子的刺激，β-catenin可能会进入细胞核[24-26]。在细胞核中，β-catenin可与转录因子 LEF相互作用，触发Wnt/β-catenin下游基因的转录和表达[27]。文献[28]报道，龙葵碱通过调控p-AKT、Cleaved Caspase 3和p53蛋白表达抑制卵巢癌细胞增殖。TRIM21调控β-catenin抑制人结直肠癌细胞增殖[29]。

肿瘤发生的基础是β-ctenin细胞核中的异常积累，原癌基因c-myc 激活，引发β-ctenin和Cyclin D1 的上调[30]。β-catenin作为Cyclin D1的直接调控基因，β-catenin上调可激活Cyclin D1表达[31]。Cyclin D1已被确定为调节细胞周期不可或缺的因素，是细胞周期蛋白家族的一员[32]。Cyclin D1和p21负责调控Cyclin D1/CDK/CKI信号通路，监测G1期到S期的过渡，从而调控细胞分裂和增殖[23]。p21 是一种含有 165 个氨基酸的蛋白质，细胞正常增殖时，在p21 N 端，p21与细胞周期蛋白 D/E/A 结合形成复合体[33]。在细胞中饥饿会引起p21积累，CDK/Cyclin复合物解聚，细胞则停留在G1期[34]。本研究证实AF抑制了骨肉瘤细胞内Cyclin D1并促进p21的表达，抑制骨肉瘤细胞增殖。文献[35]报道，AF对卵巢癌细胞的抑制作用主要靠调控S 期激酶相关蛋白2(Skp2)的表达。有研究[36]证实，AF抑制人肝癌细胞增殖主要通过下调ERK 表达。

本研究证实AF可调控细胞内周期蛋白进而抑制骨肉瘤细胞增殖。这一发现为骨肉瘤的临床诊治提供了新的理论参考和依据。