低分子量骨胶原肽酶解制备工艺优化和特性分析

姚玉梅 袁湘汝 韩鲁佳 杨增玲 刘 贤

(中国农业大学工学院，北京 100083)

0 引言

目前，环保型胶黏剂主要包括蛋白胶、淀粉胶、木质素胶、单宁胶等[1]。其中，基于蛋白质及其蛋白质水解产物衍生的蛋白基胶黏剂因其特有的高固含量、无毒无害、优异的热塑性和易降解性受到了国内外研究者的关注。

我国动物蛋白质产品总产量稳居世界首位，据统计，2019年我国肉类产量达7 758.8万t[2]。作为畜禽屠宰的副产物，畜禽骨骼占胴体的20%～30%，年产量约为2 000万t。畜禽骨骼中富含脂质、蛋白质骨胶原、软骨素和矿物元素等营养成分，可作为一种优质的蛋白质资源和脂质来源，对其开展深度综合利用和高值高效转化对环境保护和资源循环利用具有实际意义。受限于动物骨骼独特的组成结构和组成成分，动物骨骼中的胶原蛋白常经水解工艺制备骨胶原肽，后与其它化学交联剂制备骨蛋白基胶黏剂[3-5]，其化学式为C102H151O39N31，现已应用为生物质燃料胶黏剂、铸造胶黏剂、纸塑胶黏剂、标签胶黏剂[6]。

骨胶原肽的分子量分布对骨胶原肽基复合材料的性能和微结构影响显著，即在一定的骨胶原肽分子量区间内，其材料化开发的结构与性能最优[7-9]，更利于骨胶原肽基材料的增值增效与应用推广。当分子量分布较广或较窄时，易导致复合材料的防潮性差、初黏性低、力学性能差等问题[9]，这是由于蛋白质的水解程度不仅影响了骨胶原肽分子量分布，还间接影响了其理化性能，如溶解度、胶凝能力、起泡性和稳定性[10-11]。一般而言，水解度与蛋白酶解产物的分子量及分布呈负相关，即水解度较低时，分子量较大且分布区间较宽；水解度较高时，分子量变小、分布区间较窄，而产物的分子量越接近中心值，分子量分布区间越小，分子量的均一性就越好。而骨粉的粒径、脂肪含量、蛋白质含量和酶解工艺都会影响骨蛋白的水解效率[5,12-13]。为寻求水解度与骨胶原肽材料特性的最佳平衡点，制备均一性的低分子量骨胶原肽，国内外研究学者展开了深入的探讨，前期研究结果表明：脂肪酶预处理可以通过去除骨粉蛋白上的脂质、暴露骨蛋白来改善蛋白质的酶解敏感性[11]，有利于降低骨胶原肽的分子量分布区间；而双酶分步酶解工艺可以显著提高蛋白的水解效率来降低骨胶原肽的分子量[8,14]，但是探讨两者复合使用对酶解效果和酶解产物特性的影响鲜有报道。

本文考察不同种类蛋白酶对牛骨粉的酶解效果，并筛选和优化低分子量骨胶原肽制备工艺；结合酶解过程中各项指标的变化、产物表征分析和Person相关系数法考察不同酶解工艺对产物特性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

实验材料：取自北京福成屠宰场的牛骨，经去离子水清洗干净后，剔除可见残肉和骨髓，于-40℃、0.1 MPa下冷冻干燥72 h后，粉碎过0.5 mm筛，于-20℃冰箱密封储存。脂肪酶P1000，购自深圳绿微康生物工程有限公司，标称酶活为100 000 U/g；风味蛋白酶500 MG，复合蛋白酶Protamex 1.6，中性蛋白酶0.8 L，碱性蛋白酶2.4 L，均购自丹麦Novozym公司，标称酶活分别为500 LAPU/g，1.5 AU/g，0.8 AU/g，2.4 AU/g。甲醛溶液，十二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，分析纯，西陇化工股份有限公司；考马斯亮蓝G250，分析纯，成都西亚化工股份有限公司。

实验设备：XS105型分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；Research plus型微量可调移液器(Eppendorf公司，德国)；TCYQ型水浴恒温振荡器(苏州市培英实验设备有限公司)；PHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；TW20型恒温水浴锅(JULABO公司，德国)；SevenEasy型实验室pH计(Mettler Toledo公司，瑞士)；ZDJ-4A型自动电位滴定仪(上海精密科学仪器有限公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计(Shimadzu公司，日本)；Pulverisette 15型粉碎机(Fritsch公司，德国)；ST85B3-I型冷冻干燥机(Millrock公司，美国)；Spectrum400型傅里叶变换红外光谱仪(PerkinElmer公司，美国)；RID-20型示差折光检测器(Shimadzu公司，日本)；D8 Advance 型X射线衍射仪(Bruker公司，德国)；SDT Q600型热重分析仪(TA公司，美国)；岛津高效液相色谱仪(Shimadzu公司，日本)。

1.2 双酶分步酶解工艺设计

将骨粉用一定pH值的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解，配置成一定质量浓度的骨粉溶液。参考4种蛋白酶的酶解工艺参数[14]，分别调节骨粉溶液的初始pH值，进行4种蛋白酶的酶解实验，具体工艺参数如表1所示。蛋白酶解过程后，于90℃下酶失活10 min。对不同酶解工艺处理后的酶解产物在离心速率4 000 r/min下离心20 min，收集上清液于4℃保存，取部分上清液测定其水解度；去离子水反复洗涤后收集酶解残渣，用于后续的化学和结构分析。酶解反应均设3组平行实验。评估4种蛋白酶的酶解效果，充分考虑不同种类蛋白酶最适酶解工艺参数的差异性，设计双酶分步酶解工艺，考察其酶解效率，从而制定两种效率最佳的双酶分步酶解工艺。

表1 4种蛋白酶的酶解工艺参数Tab.1 Enzymatic hydrolysis conditions of four proteases

1.3 不同骨胶原肽制备工艺设计

参考前期研究结果，选定脂肪酶预处理工艺参数为：底物质量浓度0.09 g/mL、初始pH值7.5，加酶量为0.08%、反应温度40℃、反应时间4 h[11]。采用无预处理+双酶分步酶解工艺、预处理+双酶分步酶解工艺制定4种复合酶解工艺，开展低分子量骨胶原肽制备实验。每组制备工艺均设3组平行实验。

1.4 酶解效果评价指标测定

1.4.1水解度

采用甲醛电位滴定法测定水解度[15]。取5 mL酶解上清液于烧杯中，加入60 mL蒸馏水，启动磁力搅拌器，用0.05 mol/L 标准滴定溶液滴定至pH计指示pH值8.2，记录消耗的NaOH溶液体积。然后加入10 mL甲醛溶液至烧杯中，混匀后再用上述NaOH溶液继续滴定至pH值9.2，记录消耗的NaOH溶液体积，记为V1。同时记录空白试验组的NaOH消耗体积，记为V2。水解度计算公式为

(1)

式中c——NaOH标准溶液浓度，mol/L

V——酶解液总体积，mL

N——样品总氮质量分数，%

m——测定样品初始质量，g

1.4.2可溶性蛋白含量

采用紫外分光光度计测定可溶性蛋白含量(质量比)[16]。以牛血清蛋白为标准蛋白液，在595 nm波长处测定其吸光度，绘制标准曲线后测定水溶性蛋白样品的蛋白质含量。可溶性蛋白含量计算公式为

(2)

式中S——可溶性蛋白含量，mg/g

Cp——标准曲线反映的蛋白质量，mg

Vs——测定时使用体积，mL

1.4.3残渣量

残渣量是指酶解后剩余残渣占酶解样品的质量分数，该指标在一定程度上反映了骨蛋白的回收效率[17-18]。经不同蛋白酶工艺后的剩余固体残渣于25℃自然晾干后称量，即为残渣的质量。残渣量计算公式为

(3)

式中m1——酶解后的残渣质量，g

1.4.4pH值

初始pH值将显著影响脂肪酶和蛋白酶的活力，适宜pH值条件下酶分子结构/活性稳定使得酶解效率较高[19]。参考GB/T 22592—2008，测定pH值方法如下：取10 mL酶解上清液于小烧杯中，将电极浸入试样中，小心摇动或进行搅拌，读数稳定时记下pH值，准确值0.01。每个试样进行3次测定，取均值作为该试样的pH值。

1.5 骨胶原肽产物特性分析

采用分子量排阻的高效液相色谱的方法(SE-HPLC)，使用岛津高效液相色谱仪分析牛骨蛋白水解物的分子量分布，操作步骤参考文献[12]略有改动。试样液经0.45 μm微孔滤膜过滤。采用TSKgel GMPWXL型水相凝胶柱(日本TOSOH公司)，柱温为35℃，进样量为20 μL，洗脱液是0.1 mol/L NaNO3+0.06 % NaN3水溶液，流速为0.6 mL/min。使用窄分布聚乙二醇(PEO)标样组(日本TOSOH公司)作为分子量标样，采用HW-2000 GPC型色谱工作站计算物质的统计分子量、分子量分布宽度指数。

采用高效液相色谱分析牛骨蛋白水解物的氨基酸组成，操作步骤参考文献[20-21]，略有改动。采用C18型色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)，柱温为40℃，进样量为10 μL，检测波长为254 nm，流动相A是体积比为93∶7的pH值6.50的0.1 mol/L醋酸钠溶液和乙腈溶液，流动相B为体积比为20∶80的水和乙腈溶液，流速1.0 mL/min。

在-48℃真空条件下干燥48 h的4种骨胶原肽作为试样进行热稳定性分析，参照文献[22]，略有改动。操作条件如下：称取5～6 mg试样，以氮气为载气，流速为100 mL/min，以10℃/min的升温速率升温到700℃。

对试样进行官能团特征分析，采用KBr压片法，以1∶100质量比混匀，检测时红外分析扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1[22]。

一般情况下，结晶度越高，熔点越高，韧性越差，透光性越差。获取试样的X射线衍射图谱，具体参数设置如下：在CuKα射线下，X光管电压40 kV，管电流40 mA，5°～60°范围内，扫描频率为2(°)/min，扫描步宽为0.02°，叠扫3次，测定X射线衍射图谱[22]。

1.6 数据分析

采用Origin 8.5制图(OriginLab公司，美国)。数据均采用SPSS V20.0软件(IBM公司，美国)进行单因素方差分析，采用LSD检验对数据进行显著性差异分析，在95%置信区间被认为具有统计学意义(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 双酶分步酶解工艺对酶解效果的影响

2.1.1不同种类蛋白酶的酶解效果

参照表1中各蛋白酶的最佳酶解工艺参数进行牛骨粉的酶解试验，其酶解效果及过程变量数据见表2。由表2可知，4种蛋白酶酶解能力各不相同，这是由于不同蛋白酶的作用位点具有特异性，即使同一底物原料也会有不同的水解能力。其中，采用碱性蛋白酶得到最高水解度，高达8.81%，这可能是由于在碱性条件下，骨蛋白质更易于展开，且碱性蛋白酶本身的水解位点选择性较为宽泛[23]，除水解疏水性氨基酸外，还可以水解色氨酸和丙氨酸形成的肽键，同时具有酯酶的活力[24]。可溶性蛋白含量可作为反映酶解过程中蛋白质变性和降解等多方面信息的特征参数，在4种蛋白酶解液中具有显著性差异。酶解后的残渣量没有显著性差异，且与水解度无明显规律性，这可能是酶解过程中不同种类的蛋白酶附着在骨粉样品上造成的。酶解液pH值变化值表明酶解液pH值变化较小，均在初始pH值处波动，但是整体在向中性靠近，这可能是由于随着酶解反应的进行，酶解液中的含氨基或含羧基的游离氨基酸与缓冲液中的磷酸根离子发生取代反应，从而中和了酶解液。

表2 4种蛋白酶的酶解效果分析Tab.2 Effects of four proteases on enzymatic hydrolysis

2.1.2双酶分步酶解工艺的酶解效果

蛋白酶解过程中为避免过多的盐类添加，常以pH值的变化趋势来制定双酶分步酶解工艺，即碱性—中性—酸性[8]。此外，蛋白酶的分步加入可使两种蛋白酶的酶活分别达到最高值，且消除两种蛋白酶同时加入存在互为底物的干扰。为进一步探究两种蛋白酶的复合应用对牛骨蛋白酶解反应的影响，对酶解过程中各指标的变化趋势进行了统计分析，结果如表3所示。以经单一碱性蛋白酶处理的骨粉溶液作为双酶分步酶解对照组。由表3可知，在经碱性蛋白酶酶解后再加入第2类蛋白酶处理将会明显提升酶解效率，其水解度从大到小依次为：碱性蛋白酶-风味蛋白酶组、碱性蛋白酶-复合蛋白酶组、碱性蛋白酶-中性蛋白酶组、双酶分步酶解对照组，水解度分别为14.09%、11.09%、10.18%、8.81%。碱性蛋白酶-风味蛋白酶组的水解度最高的原因可能是碱性蛋白酶先将蛋白质分子的内部肽链裂开使其暴露，风味蛋白酶作为内切酶和外切酶，会从肽链末端将氨基酸水解下来。碱性蛋白酶-风味蛋白酶组的可溶性蛋白含量也佐证了这一推断。此外，由表1可知，风味蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶的最适宜pH值分别为7、7.5、6.5，结合表3中酶解液pH值的变化，选择风味蛋白酶、复合蛋白酶作为第2步酶解蛋白酶时，无需人工调节pH值，即可避免引入新的杂质。

表3 双酶分步酶解的酶解效果统计分析Tab.3 Effects of double-enzyme stepwise hydrolysis on enzymatic hydrolysis

2.2 不同酶解工艺对骨蛋白酶解效率的影响

图1(图中K1组为碱性蛋白酶酶解工艺；A组为碱性蛋白酶-复合蛋白酶酶解工艺；B组为碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺；C组为脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-复合蛋白酶酶解工艺；D组为脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺)展示了碱性蛋白酶-复合蛋白酶酶解工艺、碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺、脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-复合蛋白酶酶解工艺、脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺的4种复合酶解工艺对牛骨粉的酶解效果，水解度从大到小依次为：D组、C组、B组、A组，分别为19.02 %、16.12 %、14.09 %、11.09%。由图1可知，采用双酶分步酶解工艺、脂肪酶+双酶分步酶解工艺对骨蛋白的酶解反应具有积极的促进作用；脂肪酶预处理对水解度具有积极的促进作用，水解度提高了近5个百分点，进一步证实脂肪酶预处理可显著提升酶解效率，与先前的研究结果一致[11]。

图1 4种复合酶解工艺对水解度的影响Fig.1 Effects of four prepared progresses of ossein peptides on DH

2.3 骨胶原肽的理化性质分析

2.3.1肽分子量分布

由3～9个氨基酸残基组成的短链肽被称为低聚肽，其分子量范围为180～1 000 Da。一般而言，水解度越高，低聚肽占比越高，分子量越小，分布区间越窄[25]。通过凝胶色谱柱的出峰时间来区分样品分子量的大小，分子量大的较早出峰，分子量越小出峰时间越晚。由于采用的统计平均方式不同，便得到不同的平均分子量，即最常用的数均分子量Mn、重均分子量Mw、z均分子量Mz和粘均分子量Mz+1，其中Mn、Mw均有明确的物理意义，而Mz、Mz+1只是一种统计平均的方法，无明确的物理意义[12]。而肽分子量的分布系数Mw/Mn和分子量分散度Mz/Mw常作为衡量分子量均一性的指标，其数值越大，表明分子链长短分布越不均、越不集中，分子量均一性越差。分别将A、B、C、D组4种复合酶解工艺下制备的骨胶原肽编号为OP1、OP2、OP3、OP4。由图2可知，4种骨胶原肽的淋出时间和信号强度上具有较大差异，随着水解度的增加，淋出时间前移；相较于OP3，样品OP1、OP2、OP4的洗脱峰都相对较宽，说明其分子量分布较广，不均一；且样品OP1和OP4中出现肩峰(图2a和图2d)，说明在该淋出时间下分子量相近，所占比重较高。从谱图上看，4种骨胶原肽样品的分子量差异较小，分子量分布呈先集中后分散的趋势。由表4可知，4种骨胶原肽的Mw分别为947、1 021、883、866 Da，进一步佐证了脂肪酶预处理对降低骨胶原肽分子量的积极促进作用。结合水解度和Mw数据分析可知，相较于其它3组，采用脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-复合蛋白酶酶解工艺获得的骨胶原肽的肽分子量分布具有一定的优越性。这一结果也表明，片面提升水解度不一定会获得优质的骨胶原肽，寻求水解度、肽分子量分布、骨胶原肽材料特性间的平衡关系的相关研究具有重要的探讨意义。

表4 4种骨胶原肽的平均分子量Tab.4 Average molecular weight of four kinds of ossein peptide samples

图2 4种骨胶原肽的淋洗时间-信号强度曲线Fig.2 Relation between leaching time and signal strength curves of four ossein peptide samples

在本研究中使用的碱性脂肪酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶单价分别为500、1 000、1 000、1 000元/kg，参考表1中各蛋白酶的酶解工艺参数可知，每处理1 kg牛骨粉样品所需蛋白酶理论添加量分别为7.40 g、42.3 mL、67.68 g、28.2 g，折合成本增加3.7、42.3、67.68、28.2元/kg。而在水解度和肽分子量相差无明显差异的情况下，脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺具有更好的经济可行性。

2.3.2氨基酸组成

通过HPLC对4种骨胶原肽样品的氨基酸组成定性分析可知，4种骨胶原肽样品中含有丰富的游离氨基酸，其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和赖氨酸含量较高。由图3可知，OP4的总游离氨基酸含量最高，可达257.760 mg/g；OP2次之，为204.848 mg/g，这可能是由于作为内切酶和外切酶的风味蛋白酶有利于游离氨基酸的释放。此外，经脂肪酶预处理后的OP3和OP4样品的氨基酸含量也明显增加。

图3 4种骨胶原肽的氨基酸组成谱图Fig.3 Chromatograms of amino acid composition of four kinds of ossein peptide samples

2.3.3热重分析

图4为4种骨胶原肽样品的热重分析结果。试样在升温开始阶段50～150℃范围有一个较大的失重峰，这明显是样品中水分的蒸发过程；150～350℃范围样品的失重速率明显提高，并达到峰值。从图4中发现，4种骨胶原肽样品的失重曲线相差不大，均在90、200、370℃发生明显失重，其中样品OP1和OP3的质量损失率最高，为48.61%和47.38%。4种骨胶原肽样品的失重速率曲线具有明显差异，随着水解度的升高，样品的最大降解温度向左偏移，热稳定性呈降低趋势。在90℃附近，样品OP3和OP4的失重速率明显高于其它两种，这是因为随着分子量的减小，防潮性变差导致样品中的含水率较高；在 200～500℃附近，OP1和OP2样品的失重速率明显高于OP3和OP4，这是因为270～350℃和350～460℃分别是蛋白质和脂质的特征分解温度区间[26]，样品中混合着的不同含量的蛋白酶与脂质引起了此差异，如，经脂肪酶预处理的OP3和OP4样品中含有一定的脂肪酶(本质属于蛋白质)，故在300℃附近的蛋白质峰处失重速率较高，而未经脂肪酶预处理的OP1和OP2 样品中脂质含量较多，故在350℃附近的脂质峰处失重速率较高。

图4 4种骨胶原肽样品的热重分析Fig.4 Pyrolysis characteristics of four kinds of ossein peptide samples

2.3.4红外谱图分析

图5 4种骨胶原肽样品红外谱图Fig.5 FT-IR spectra of four kinds of ossein peptide samples

2.3.5X射线衍射谱图分析

由图6可以看出，4种骨胶原肽样品在2θ为10°和20°附近处分别出现了衍射峰，而这两个衍射峰是胶原蛋白的特征衍射峰[30]。其中，在2θ=8°处的比较尖锐的衍射峰可以反映骨胶原肽分子量间的距离，在2θ=20°处的较宽的衍射峰是骨胶原肽内部结构引起的漫散射。此外，2θ=31°处的衍射峰可以反映胶原蛋白质中三股螺旋结构单元的组成[31]。而4种骨胶原肽在此处的实测衍射强度具有较大的差异，衍射峰强度较高的原因可能是骨胶原肽中含有部分未分离出的蛋白酶或是脂肪蛋白酶。而OP3在2θ=31°处的衍射峰明显低于其它3种，这可能是由于随着水解度的提高，产物中肽分子量分布更加均匀集中，结晶度在一定程度上呈降低趋势，其中，OP3样品中大部分三股螺旋结构已被破坏，衍射峰强随之降低。

图6 4种骨胶原肽的XRD 谱图Fig.6 XRD spectra of four kinds of ossein peptide samples

2.4 Person相关系数

采用Person相关系数法对4种复合酶解工艺中牛骨粉酶解反应的过程变量进行分析，探究水解度与骨胶原肽产物特性间的关系，结果如图7所示。以显著性水平进行显著性标记来绘制图形，以红色标记表示正相关，以蓝色标记表示负相关，显著相关以“*”标记表示。一般而言，相关系数越大，颜色越深，关系越强。由图7可知，水解度与Mn、Mw呈负相关关系，与Mz、Mz+1、Mw/Mn、Mz/Mw及总游离氨基酸含量呈正相关关系，这表明随着水解度的提高，骨胶原肽的分子量在降低，但是自身黏性增加，分子量分布发散度呈变大的趋势。此外，除Mn外，Mw与其它指标呈负相关关系；总游离氨基酸含量与Mn、Mw呈负相关，即肽分子量越大，氨基酸含量越低，这表明了水解度程度较低会影响氨基酸从肽链上脱离，进一步佐证了上述推断。

图7 牛骨蛋白酶解效率和过程变量的相关性分析Fig.7 Correlations between enzymolysis efficiency and various properties of ossein peptide samples

3 结束语

以前期研究结果证实的骨胶原肽高值高效材料转化利用所需的材料特性为导向，本文以制备均一性的低分子量骨胶原肽为研究目标，考察脂肪酶预处理、多酶分步酶解工艺以及两者的复合应用对牛骨粉酶解效果的影响，筛选出最佳的均一性低分子量骨胶原肽制备工艺；并对4种骨胶原肽样品的理化性质进行系统分析，进一步探究不同复合酶解工艺下制备的骨胶原肽的产物特性。研究发现，脂肪酶预处理与双酶分步酶解工艺的复合应用可以显著提升水解度，改善酶解产物的分子量分布和氨基酸组成。其中，采用脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-复合蛋白酶的酶解工艺制备的低分子量骨胶原肽性能综合表现最优，其重均分子量、分子量分布系数和分散度分别为883 Da、9.73和7.91，水解度为16.12%；而采用脂肪酶预处理-碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解工艺的水解度、总游离氨基酸含量最高，分别为19.02%、257.76 mg/g，骨胶原肽产物特性也表现优异。此外，随着水解度的提高，骨胶原肽的肽分子量分布系数降低，骨胶原肽的热稳定、结晶度也出现轻微降低，这是由胶原蛋白的三股螺旋结构被破坏引起的，而这些结构和组成的变化都将在一定程度上利于骨胶原肽的材料增值转化，故寻求水解度与材料特性的最佳平衡点可以兼容蛋白回收的经济性、生产工艺的清洁高效、新型材料性能的安全稳定性。