五味子多酚的提取及体外抗氧化性研究

董树国，霍玲玲，邵千禧，王 敏 (吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

五味子为木兰科藤本类植物，因五味子果实有酸、甘、苦、辛、咸共五味，故称五味子。五味子可兴奋人体的中枢神经及呼吸系统，并且对人们血压、肝脏、心脏有一定调节能力，对人的视觉能力及听觉能力有强化作用，能够促进分泌胆汁，提高抗菌能力[1]。现代研究表明，五味子中含有多种能对人身体产生影响的化学成分，主要含有有机酸、木脂素、多糖、多酚、氨基酸等化学活性成分[2-3]。超声波提取新技术是利用超声的空化作用加速植物有效成分的溶出，提高有效成分的提取率和原料的利用率，已广泛用于植物多酚的提取[4-5]。本研究利用超声波提取进行五味子多酚的提取，以多酚提取率为考察指标，以提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度为考察因素，利用正交试验法对其提取条件进行优化，并研究了五味子多酚对超氧阴离子自由基、羟自由基、2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基的清除能力，为进一步研究与应用五味子多酚提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子(吉林省长白山区)；没食子酸(纯度>99%，国药集团化学试剂有限公司)；硫酸亚铁、邻菲啰啉(分析纯，沈阳大庆试剂；)三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、DPPH(分析纯，麦克林试剂有限公司)；焦性没食子酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T6新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 没食子酸标准曲线的绘制

取7个10 mL容量瓶，分别准确加入2.0 mg/mL没食子酸标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别加入酒石酸亚铁溶液4 mL，用KH2PO4-NaH2PO4(pH值7.5)的缓冲溶液定容至刻度，静置5 min，测定溶液在540 nm处的吸光度。以没食子酸标准液浓度及吸光度值分别为横、纵坐标，绘制出没食子酸标准曲线，并拟合线性方程为Y=1.583X-0.007 7，R2=0.999 6。在浓度范围0.1～0.6 g/L内没食子酸标准溶液吸光度与浓度呈线性关系。

1.3 五味子中多酚提取及含量测定

称取五味子粉末2.0 g，按照不同的料液比加入乙醇溶液，进行超声波辅助提取，分别移取适量实验所得的多酚提取液，利用酒石酸亚铁法测定提取液中多酚的浓度并计算提取率[6-7]。

1.4 正交试验

根据前期实验结果，以提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度为考察因素[8-9]，选取五味子多酚的提取率作为考察指标，利用L9(34)正交试验进行优化，正交试验的因素水平设定见表1。

表 1 正交试验因素水平设计

1.5 体外抗氧化实验

1.5.1邻苯三酚自氧化法测定清除超氧阴离子能力

取10 mL容量瓶7个，1～5号容量瓶中放入50 mmol/L pH值8.2的Tris-Hcl缓冲液3 mL，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的五味子多酚提取液，取25 mmol/L邻苯三酚1 mL加入，震荡混匀，6号管不加入邻苯三酚溶液，而7号管以蒸馏水替代五味子多酚提取液，在25 ℃条件下，进行20 min水浴，滴加一滴浓盐酸以终止反应，在420 nm波长处测定吸光度，对每份样品进行3次测定，取三者的平均值。计算超氧阴离子自由基的清除率[10-11]。

1.5.2Fenton法测定清除羟自由基能力

取11个10 mL的容量瓶，在1号容量瓶中加入7.5 mmol/L邻菲啰啉溶液1.0 mL，再加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL，7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL，0.1%的H2O21.0 mL，采用去离子水进行定容，在37 ℃下水浴1.0 h，在波长为536 nm处测定吸光度值。在2～6号容量瓶中分别加入体积为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的五味子多酚提取液，7号容量瓶中不加入H2O2及五味子多酚提取液，重复上述1号容量瓶的操作，分别测其吸光度值。计算羟自由基的清除率[12]。

1.5.3分光光度法测定清除DPPH自由基能力

取10mL的容量瓶11个，在1～5号容量瓶中分别放入样品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和2 mL 0.04 g/L的DPPH溶液，以无水乙醇定容，以无水乙醇为参比溶液，在波长517 nm处测定吸光度。在6～10号容量瓶中分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的样品溶液和2 mL的无水乙醇溶液，在波长517 nm处测定吸光度。11号容量瓶加入2 mL DPPH溶液和2 mL乙醇，摇匀后于40 ℃避光静置10 min，以无水乙醇定容，测定吸光度。计算样品清除DPPH自由基清除率[13-14]。

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果

正交试验结果见表2。结果表明，对五味子多酚提取率影响最大因素为超声温度，然后依次为时间、料液比和乙醇浓度。筛选出的最佳提取工艺条件组合为A3B3C2D1，即提取温度为65 ℃，乙醇浓度80%，料液比(g/mL)1∶25，超声时间10 min。

在正交试验的基础上，按照最佳提取条件进行3次重复提取，得出提取率分别为5.42%、4.94%、5.14%，RSD为4.67%，表明五味子多酚的最佳提取工艺条件具有较好的重现性。

2.2 体外抗氧化性结果

2.2.1清除超氧阴离子自由基的能力

五味子多酚对超氧阴离子自由基的清除能力结果见图1。由图1可见，五味子多酚对超氧阴离子自由基的清除率随着浓度增加而增加，当五味子多酚浓度为4.5 mg/L时，对超氧阴离子自由基的清除率为42.1%，当五味子多酚浓度提高到27 mg/L时，对超氧阴离子自由基的清除率为87.9%。

表 2 正交试验结果

2.2.2清除羟自由基的能力

五味子多酚对羟自由基的清除率结果见图2。由图2可见，当五味子多酚浓度为4.5 mg/L时，对羟自由基的清除率为45.6%，当五味子多酚浓度提高到27 mg/L时，对羟自由基的清除率为85.8%。当五味子多酚浓度较低时，随着多酚浓度的升高，对羟自由基清除率的趋势增加较明显，当五味子多酚浓度较高时，羟自由基的清除率增加趋势较为缓慢。

2.2.3清除DPPH自由基的能力

五味子多酚对DPPH自由基的清除率结果见图3。由图3可见，当五味子多酚浓度为9.0 mg/L时，对DPPH自由基的清除率为4.76%，当五味子多酚浓度提高到54.0 mg/L时，对DPPH自由基的清除率为83.8%，当五味子多酚浓度低于36 mg/L时，随着多酚浓度的升高，对DPPH自由基的清除率增加较明显，当五味子多酚浓度高36 mg/L时，DPPH自由基的清除率增加趋势较为缓慢。

图 1 超氧阴离子的清除试验结果 图 2 羟自由基清除试验结果 图 3 DPPH自由基清除试验结果

3 结 论

利用超声波辅助提取法提取五味子多酚，通过正交试验，得出五味子多酚超声波辅助提取的最佳提取工艺为：超声温度65 ℃，乙醇浓度80%，料液比(g/mL)1∶25，超声时间10 min，通过重复性实验表明，五味子多酚最佳提取工艺具有较好的稳定性。抗氧化性研究，结果表明，随着五味子多酚浓度的升高，对超氧阴离子自由基、羟自由基及DPPH清除率也随之升高，显示五味子多酚具有良好的抗氧化活性。