黄药子中黄独乙素提取工艺研究

林 瑞，杜秋旻，李永春，闫美霖，何家丽，苗晶囡，徐 丹，邱军强 (海南医学院药学院，海南 海口 570100)

黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独(DioscoreabulbiferaL)的块茎，在我国的海南岛主要分布于崖县、保亭、东方、澄迈和琼海等地[1-2]。唐代《千金·月令》最早记载：“以万州黄药子浸酒可治瘿疾”；而在《开宝本草》中则记载着：“主诸恶肿疮瘘、喉痹、蛇犬咬毒”；《本草纲目》将其功效则记录为：“凉血降火、消瘿解毒”；《海南植物志》所收载的功效为：“零余薯，具有止血、去毒的功用，可治疝气、腰痛”。《现代中药大辞典》描述为：“临床常用黄药子单、复方制剂治疗食道癌、胃癌、直肠癌和甲状腺癌等多种癌症，为当今治疗癌症的主要中药之一”。其中黄独乙素作为黄药子的主要活性成分之一，对多种肿瘤细胞的增殖均具有抑制作用[3-5]。因其具有广泛的药理活性，对黄独乙素进行提取工艺优化具有重要意义。本研究采用超声波提取法，利用超声波的空化效应有效提高黄独乙素的得率，缩短提取时间[6-7]。同时借助响应面法优化法确定料液比、提取时间和超声提取次数等因素，从而得到黄独乙素的最佳提取条件，旨在为后续的黄独乙素相关研究中提供理论依据。

1 仪器与试剂

百丽福-150中药粉碎机(永康市敏业工贸有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，SB25-12DTD超声波提取器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，高效液相色谱仪(美国Waters)，EYELA-1001旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

黄独乙素标准品购于南京源植生物科技有限公司，黄药子饮片购于海口永敬堂药业，无水乙醇、甲醇等化学试剂均为国产分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 黄独乙素标准曲线的建立

准确称取10 mg黄独乙素标准样品，甲醇溶液定容至100 mL，配制成100 mg/L的标准样品母液。将母液进行稀释，依次配成浓度为4、6、8、10、12、14和16 mg/L的10 mL标准溶液。分别取5 μL不同浓度标准溶液通过高效液相色谱仪进行测定，采用Symmetry C18(150 mm×3.9 mm,5 μm)，以甲醇-水-磷酸(40∶60∶0.08)为流动相，流速0.8 mL/min，检测波长为215 nm[8-9]。每个试验设置3个平行，取其平均值。结果分别以黄独乙素浓度(mg/L)、峰面积为X轴和Y轴，制作标准曲线并得出回归方程和回归系数。回归方程为Y=502 800X+13.202，R2=0.999 2，呈现良好的线性关系，可用于测定待测物质中黄独乙素的含量。

2.2 样品中黄独乙素的含量测定

准确称取贮藏备用的黄药子粉加入不同体积分数的乙醇，混合均匀后置于超声环境下进行提取，旋转蒸发仪减压浓缩，用容量瓶定容到一定体积，按照标准曲线建立的检测方法测定其中的黄独乙素含量，每个样品重复测定3次。计算黄独乙素的得率[10]。

2.3 黄独乙素的提取工艺优化

2.3.1乙醇体积分数对黄独乙素得率的影响

分别研究乙醇体积分数为10%、15%、20%、35%、40%、55%、60%、75%、80%、90%，固定料液比(g/mL)为1∶80、提取次数为3次、超声时间为5 h的条件下，考察乙醇体积分数对黄独乙素得率的影响。结果表明不同乙醇体积分数对黄独乙素得率有一定影响，但乙醇体积分数为60%时，黄独乙素得率达到最大值。因此选择最佳的乙醇体积分数为60%进行后续的试验设计。

2.3.2料液比对黄独乙素得率的影响

分别研究料液比(g/mL)为1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160和1∶180，固定乙醇体积分数为60%、提取次数为3次、超声时间为5 h的条件下，考察料液比对黄独乙素得率的影响。结果表明，随着料液比的增加，黄独乙素的得率也在不断增加，当料液比(g/mL)为1∶60时就达到了峰值，之后再增加料液比对黄独乙素得率的提高没有太大影响。推测可能溶剂的增加，使得黄药子中一些可溶性的化学成分溶解量也逐渐增加，从而对黄独乙素的提取有一定的影响[11]。所以在后续的研究中，最后选择最佳的料液比(g/mL)为1∶60。

2.3.3提取次数对黄独乙素得率的影响

分别研究提取次数为1、2、3、4、5、6、7次，固定料液比(g/mL)为1∶80、乙醇体积分数为60%、超声时间为5 h的条件下，考察提取次数对黄独乙素得率的影响。结果表明，提取次数对黄独乙素得率的影响相对较小，提取3次后黄独乙素得率已达到稳定，再增加提取次数，其得率也没有明显的提高。因此，选择最佳提取次数为3次[11]。

2.3.4超声提取时间对黄独乙素得率的影响

分别研究超声提取时间为1、2、3、4、5、6和7 h，固定料液比(g/mL)为1∶80、乙醇体积分数为60%、提取次数为3次的条件下，考察超声提取时间对黄独乙素得率的影响。结果表明，在超声提取时间2 h之前，随着超声时间的延长，黄独乙素的得率不断增加，当提取时间达到5 h以后，黄独乙素的得率增加的较为缓慢。因此考虑提取成本和实际情况，选择最佳提取时间为5 h[12]。

2.4 响应面优化试验设计

依据单因素的试验结果，由于乙醇浓度对黄独乙素的得率影响呈现一定的规律性变化，在乙醇体积分数为60%时，黄独乙素的得率达到最高，乙醇体积分数过低或者过高均不利于黄独乙素的提取[13]。因此后期单因素试验固定提取黄独乙素的乙醇体积分数为60%。

通过Design-export软件并根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平试验方案优化提取工艺。其中响应值为黄独乙素的得率，自变量为提取次数、提取时间和料液比，对黄独乙素的提取工艺作进一步优化。试验因素与水平见表1。

表 1 响应面试验因素与水平

2.4.1响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以黄药子中黄独乙素的得率(Y)为响应值，以提取次数(A)、提取时间(B)与料液比(C)3个因素为自变量，利用Box-Benhnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面进行试验。响应面优化试验的结果见表2。

表 2 响应面优化实验设计及实验结果

利用Design-export软件对建立的黄独乙素得率响应面回归模型进行方差分析，结果如表3所示。模型的F值和P值分别为5.24和0.0201，P<0.05，达到显著水平；方差分析失拟项为0.072，差异不显著；R2=0.867 6，说明该试验能较好的反映真实情况以及各因素与黄独乙素得率的联系。表3中对回归模型系数的显著性结果分析显示，二次项A2、B2、C2系数的显著性均小于0.05，且C2系数的显著性小于0.01，对黄独乙素得率的影响显著，表明A2、B2和C2对于最终的提取结果影响显著。三个影响因素对黄药子中黄独乙素的提取影响大小顺序为：提取次数<提取时间<料液比。

表 3 响应面回归模型方差分析和回归分析结果

图1和图2是提取次数、提取时间和料液比对响应值黄独乙素得率的等高线图和响应面图。等高线图均趋于扁圆形，表明这些因素之间的交互作用较为显著；反之，如果等高线图为圆形，则表示这些因素之间的交互作用不显著。同时响应面坡度的陡峭程度，表明不同因素水平的改变对响应值影响的大小。三维图中的坡度越陡，表示该因素条件对黄独乙素得率的响应值影响越大。

结果表明，交互项提取次数和提取时间、提取次数和料液比、提取时间和料液比的等高线都接近扁圆，AC交互作用所形成的扁圆趋势更加明显，说明AC交互作用更加显著，其次为BC，最后为AB。在AC和BC的3D图中可知(见图2)，与A和B方向比较，C响应面曲线较陡；在AB的3D图中可知，B响应面曲线较A的陡。以上可得出，响应面分析结果与回归模型显著性检验和方差分析结果是一致的。

图 1 因素交互作用对黄独乙素得率的影响2D图

图 2 交互作用对黄独乙素得率的影响3D图

2.4.2验证试验

根据响应面法得到黄独乙素最优提取工艺条件为：提取次数3次、提取时间5 h和料液比(g/mL)为1∶65，在这个条件下，黄独乙素得率最高，达0.377%。为了验证所建立模型的准确性，按照以上条件对黄独乙素进行实际提取，平行进行3次，测得黄独乙素的得率为(0.378±0.02)%，和预测值接近，表明优化方法和建立的模型准确，可信任。

3 讨 论

近年来，大量文献报道了药食同源天然产物活性成分，如多糖、花色苷、多酚、黄酮和挥发油等内含物的提取均采用响应面分析法对提取工艺进行优化。同时在提取过程中通过辅助超声波或者微波等提取技术进行活性成分的提取，这些提取技术显著提高了上述活性成分的提取效率。其中超声波辅助提取法是通过超声波辐射压强产生的物理效应和空化效应，促进提取液中所有化学物质分子的振动频率增加，加速各类活性成分的溶出与提取，从而提高其提取效率[14-16]。

本研究以超声波辅助提取技术对黄药子中的黄独乙素进行提取工艺研究，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面法对试验数据进行拟合，从而优化得到其最佳提取工艺。根据模型得出的最优提取工艺条件为：提取次数3次、提取时间5 h和料液比(g/mL)1∶65，此时黄独乙素的实际得率为(0.378±0.02)%。最优提取工艺的验证试验显示，优化方法和建立的模型准确，重现性好。方差分析失拟项为0.072，差异不显著，R2=0.867 6，表明该试验能较好的反映真实情况以及各因素与黄独乙素得率的联系，且优化后的试验方法的得率大于各单因素试验的得率，说明该提取工艺是合理可行的。