通管消癥饮对输卵管炎性不孕症模型大鼠血清炎症因子水平的影响及其机制

李艳青, 赵 方, 高 蕊, 吴 昕, 牛小斌

（1. 河南中医药大学第二附属医院妇科，河南 郑州 450003；2. 河南中医药大学研究生处，河南 郑州 450046；3. 河南中医药大学第一附属医院妇科，河南 郑州 450099；4. 河南中医药大学第二附属医院检验科，河南 郑州 450003）

细菌、病毒和真菌等感染因子会损害各种人类功能，包括生殖和怀孕。感染可以从阴道上升，通过子宫颈，到达上生殖道和子宫内膜，最终到达输卵管，临床表现为急性盆腔炎［1］。约15%的急性盆腔炎女性患者后期会发展为输卵管炎性不孕，并且急性盆腔炎的发作次数与不孕风险成正比［2］。不孕症是一种具有重大心理、社会和医学影响的医学病症［3］。输卵管炎性是导致不孕的最常见原因之一，占女性生育问题的30%［4］。因此，研究输卵管病变相关机制具有重要意义。中医药治疗妇科疾病历史悠久，特别是针对输卵管炎性的治疗相较西医有明显优势。研究［5］显示：活血通络方能减少输卵管炎大鼠输卵管组织炎性细胞的浸润，有效改善炎症程度，并降低输卵管炎大鼠血清白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和重组人可溶性CD40配 体/TRAP （recombinant human soluble CD40 ligand/TRAP，sCD40L）。膈下逐瘀冲剂能够调节输卵管上皮细胞核转录因子kappaB（nuclear factorκB，NF-κB）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）水平，达到消除炎症的目的，是治疗慢性输卵管炎性不 孕 有 效 冲 剂［6］。 通 管 消 癥 饮（Tongguan Xiaozheng Decoction，TGXZ） 作为治疗输卵管阻塞性不孕的经验方，由河南省中医院名中医褚玉霞创制的治疗盆腔炎经验方消癥饮化裁而来，在长期临床应用中取得较好的疗效［7-8］，但其相关作用机制尚不明确。因此，本研究通过构建输卵管炎性不孕症大鼠模型，阐明TGXZ 治疗输卵管不孕症的相关机制，为临床治疗输卵管炎性不孕提供可靠思路，对中医治疗有一定的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器SPF 级6～8 周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌性92 只，雄性18 只，体质量（210±25）g ，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产合格证号：SCXK（京） 2020-0004。SD 大鼠饲养于温度（22±2）℃，相对湿度（60±10）%，明暗周期12 h/12 h，自由进食及饮水。TGXZ（成分：薏苡仁30 g，茯苓15 g，败酱草30 g，连翘30 g，桃仁15 g，丹参30 g，赤芍15 g，桂枝9 g，黄芪20 g，川牛膝15 g，路路通15 g，皂角刺10 g，穿山甲3 g） 由深圳华润三九医药提供，甲硝唑片购自湖南汉森制药股份有限公司，盐酸左氧氟沙星胶囊购自江苏黄河药业股份有限公司，血清IL-1β、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10） 和TNF-α ELISA 试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA 蛋白定量试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司，Toll 样受体（Toll-like receptor 4，TLR4） 抗体、核因子κB 抑制 剂α（nuclear factor-κB inhibitor α，IκBα） 抗 体、磷酸化IκBα（phosphorylated IκBα，p-IκBα）抗体、NF-κB p65 抗 体、Histone H3 和GAPDH 抗 体 购 自美国Santa Cruz 公司。MK3 型酶标仪（芬兰雷勃公司），CX43 型光学显微镜（日本Olympus 公司）。

1.2 实验动物模型的制备随机选取80 只雌性SD 大鼠适应性喂养1 周后，采用混合菌阴道接种法［5］构建输卵管炎性不孕症大鼠模型：抓起大鼠，将其倒立，用碘伏消毒外阴，用塑胶巴氏滴管吸取0.1 mL 混合菌，从外阴道插入，直至子宫底后注射细菌，保持倒立约3 min，直至无菌液溢出。参考文献［5］中造模成功指标，利用肉眼观察及HE染色观察到大鼠输卵管组织出现炎性症状，确认输卵管炎性不孕症大鼠模型造模成功。

1.3 实验动物分组和给药方法将造模成功的60 只雌性大鼠随机分为模型组，西药组（甲硝唑片和盐酸左氧氟沙星胶囊），低、中和高剂量TGXZ 组，每组12 只。每组用相应的药物或蒸馏水进行灌胃，常规饲养，另取12 只正常大鼠作为正常对照组，同时常规饲养。按照人与大鼠体表面积换算出大鼠通管消癥饮等效剂量为21.33 g·kg－1·d－1，再 根 据 人 临 床 等 效 剂 量 的1.0、0.5 和0.25 倍作为本研究大鼠TGXZ 灌胃剂量，分别为低、中和高剂量（5.33、10.67 和21.33 g·kg－1）。西药组将甲硝唑片和盐酸左氧氟沙星胶囊打碎碾成粉末，蒸馏水配成0.149 g·mL－1浓度的混悬液， 给 药 剂 量 为1.49 g·kg－1。 按10 mL·kg－1给大鼠灌胃，模型组和正常对照组以等量蒸馏水灌胃，所有实验动物每日灌胃2 次，早晚各1 次，共1 剂，共灌胃30 d，且每周称体质量1 次，根据体质量调整药量。

1.4 各组大鼠一般情况药物干预结束后，观察并记录大鼠精神状态、活动量、饮水量和爪色等情况。

1.5 ELISA 法检测各组大鼠血清中炎症因子水平药物干预结束后采用眼球取血5 mL，静置30 min 后，3000 r·min－1离 心5 min，离 心 后 取 上清液，采用ELISA 法测定各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平。采用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（A） 值，通过标准曲线计算血 清 中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平。

1.6 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察各组大鼠输卵管组织病理形态表现每组随机取6 只大鼠，取出左右输卵管组织保存备用。取左侧输卵管组织，常规石蜡包埋后，切成厚度为2 μm的切片，HE 染色，参考文献［2］方法对输卵管组织进行半定量。由2 位不知情的病理观察员在显微镜（×100）下观察每张载玻片的3 个部分。通过评估炎性细胞浸润的程度（0～4） 进行半定量评分［9］。

1.7 蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测各组大鼠输卵管TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平取右侧输卵管组织，按细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒提取蛋白质。采用BCA 蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度。采用10% 的SDSPAGE 电泳，将分离出的目的蛋白转移至PVDF膜，置入5% 脱脂牛奶室温封闭1 h， 用含Tween20 的Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST） 洗涤3 次；加 入 一 抗TLR4 抗 体（1/500）、IκBα 抗 体（1/500）、p-IκBα 抗 体（1/500）、NF-κB p65 抗 体（1/500）、Histone H3（1/1000） 和GAPDH 抗体（1/1000），4 ℃孵育过夜， TBST 洗涤3 次。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次。加入ECL 发光液，反应2 min 后，曝光、显影及拍照，利用Image J 对目的蛋白条带灰度值进行定量分析，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.8 各组大鼠受孕情况灌胃结束后，对各组大鼠进行受孕观察。将每组剩余的6 只雌性大鼠随机分笼，每2 只雌性大鼠放一笼，每笼中放入1 只雄性大鼠。合笼30 d 观察受孕情况，计算各组受孕率。受孕率=受孕大鼠数/每组雌性大鼠数×100%。同时计算各组大鼠窝产仔量。

1.9 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平，输卵管组织炎性细胞浸润的程度评分，输卵管组织中TLR4、p-IκBα、IκBα 和细胞核中NF-κB p65 蛋白表达水平及窝产仔量均以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠精神状态、活动量、饮水量和爪色大体情况正常对照组大鼠精神状态良好，活动量和饮水量正常，爪色粉白；模型组大鼠精神状态萎靡，活动量和饮水量降低，爪色暗红；中和高剂量TGXZ 组及西药组大鼠的一般情况得到明显改善，特别是高剂量TGXZ 组。与模型组比较，高剂量TGXZ 组大鼠精神状态明显恢复，活动量增多，偶见蜷缩少动，饮水量增加，爪色颜色变浅。而低剂量TGXZ 组大鼠的一般情况与模型组大鼠相似，无明显改善。

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平与正常对照组比较，模型组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中剂量TGXZ 组和高剂量TGXZ 组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α水平均明显降低（P＜0.05），低剂量TGXZ 组大鼠血清中上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量TGXZ 组比较，中和高剂量TGXZ 组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平均明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平Tab. 1 Levels of serum of IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α of rats in various groups [n=12，±s，ρB/(ng·L-1)]

表1 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平Tab. 1 Levels of serum of IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α of rats in various groups [n=12，±s，ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 compared with normal control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of TGXZ group.

Group Normal control Model TGXZ Low dose Medium dose High dose Western medicine IL-1β 77.64±30.04305.68±82.69*274.52±44.25212.42±53.06△#146.93±46.11△#108.37±38.85△IL-685.22±21.08276.54±38.20*258.36±26.49212.13±23.71△#167.98±25.50△#120.03±20.85△IL-1046.40±19.18343.96±63.56*304.06±80.52213.26±77.04△#137.58±56.47△#97.25±46.11△TNF-α 612.35±212.041428.57±305.61*1275.64±264.551020.33±125.93△#884.72±149.52△#724.61±162.45△

2.3 各组大鼠输卵管组织病理形态正常对照组大鼠输卵管结构清晰，黏膜皱褶丰富，黏膜上皮细胞排列整齐，管腔通畅；模型组大鼠输卵管结构分界不清，黏膜皱褶消失，黏膜上皮细胞排列紊乱，管腔狭窄，出现梗阻和大量炎性细胞浸润等情况，并且肌层出现大量纤维结缔组织增生；中和高剂量TGXZ 组及西药组大鼠输卵管结构有改善，管壁组织结构尚清晰，黏膜上皮细胞排列欠规整，管腔通畅，仅少量炎性细胞浸润，肌层少量纤维结缔组织增生；低剂量TGXZ 组大鼠输卵管结构与模型组类似，结构分界不清、黏膜上皮细胞紊乱等情况及输卵管炎症情况无明显改善。见图1。与正常对照组比较，模型组大鼠炎性细胞浸润评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组和中及高剂量TGXZ 组大鼠炎性细胞浸润评分明显降低（P＜0.05），低剂量TGXZ 组大鼠炎性细胞浸润评分差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量TGXZ 组比较，中和高剂量TGXZ 组大鼠炎性细胞浸润评分均明显降低（P＜0.05）。见图2。

图1 各组大鼠输卵管组织病理形态表现（HE, ×100）Fig.1 Pathomorphology of fallopian tube tissue of rats in various groups (HE, ×100)

图2 各组大鼠输卵管组织炎性细胞浸润评分Fig. 2 Inflammatory cell infiltration scores of fallopian tube tissue of rats in various groups

2.4 各组大鼠输卵管组织中TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平与正常对照组比较，模型组大 鼠 输 卵 管 组 织 中TLR4 和p-IκB α 蛋 白 表 达 水平及细胞核中NF-κB p65 蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05），而IκBα 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中和高剂量TGXZ 组大鼠输卵管组织中TLR4 和p-IκBα 及细胞核中NF-κB p65 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），而IκBα 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P＜0.05），低剂量TGXZ 组大鼠输卵管组织中的上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量TGXZ 组比较，中和高剂量TGXZ 组大鼠输卵管组织 中TLR4 和p-IκB α 蛋 白 表 达 水 平 及 细 胞 核 中NF-κB p65 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），IκBα 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P＜0.05）。见 图3 和4。

图3 各组大鼠输卵管组织中TLR4、p-IκBα 和IκBα 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of TLR4, p-IκB α and IκB α proteins in fallopian tube tissues of rats in various groups

2.5 各组大鼠受孕率与正常对照组比较，模型组大鼠受孕率降低P＜0.05），窝产仔量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组和中及高剂量TGXZ 组大鼠受孕率升高（P＜0.05），窝产仔量明显提高（P＜0.05），低剂量TGXZ 组大鼠受孕率和窝产仔量差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量TGXZ 组比较，中和高剂量TGXZ 组大鼠受孕率升高（P＜0.05），窝产仔量明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠受孕率和窝产仔量Tab. 2 Conception rates and liitter sizes of rats in various groups (n=6)

3 讨论

输卵管是生殖过程中非常重要的部分。如果该部位发生细菌感染，T 辅助淋巴细胞和自然杀伤细胞会产生多种炎症募集因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 因子和炎性细胞，以去除细菌并诱发局部急性炎症反应［10］。输卵管炎属于炎症反应和纤维化增生范畴。当组织感染细菌等微生物后，可因自身免疫反应，引起炎性细胞浸润［11］，炎性细胞浸润分泌的炎性因子可诱发组织微血管通透性增加［12］，引起组织充血水肿和纤维化增生等情况。因此，抑制炎性细胞浸润是解决输卵管炎的主要治疗方向。本研究结果显示：输卵管炎性不孕症模型组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 水平均升高，且输卵管组织发生严重炎性细胞浸润，另外，模型组仅1 只大鼠受孕，这些结果验证了输卵管炎性不孕症大鼠构建成功。

图4 各组大鼠输卵管组织中NF-κB p65 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 4 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of NF-κB p65 protein in fallopian tube tissues of rats in various groups

中医解释输卵管炎不育不孕症是湿热毒邪，蕴结下焦，气机不畅，瘀血阻滞，湿热瘀血互结冲任，胞脉闭阻不通而致。治疗以清热祛湿、活血化瘀为主，佐以益气扶正之法。TGXZ 中黄芪益气扶正、防伤正；薏苡仁、茯苓及败酱草清热解毒、健脾益气；丹参、赤芍和桃仁凉血化瘀、养血活血；路路通、皂刺行气通络、通达官窍；穿山甲性微寒、入肝经血分，可通上达下、破瘀散结；川牛膝补肾活血、引药下行，诸药相合，使热清湿化，瘀消结散，胞脉畅通，精卵相合而成孕。早期临床［8］发现：TGXZ 与输卵管通液术结合治疗，患者的妊娠率和输卵管再通率均明显优于妇宝颗粒和康妇消炎栓。本研究结果显示：TGXZ 能有效降低输卵管炎性不孕症大鼠血清炎症因子水平，并且缓解输卵管组织炎性细胞浸润情况，提高不孕症大鼠受孕率。该动物实验结果与前期的临床结论以及中医论证［8］均相符。

NF-κB 是细胞重要的转录调节因子，在细胞质内以p50-p65 异二聚体形态与IκB 结合呈非活化状态。NF-κB 是促进参与炎症和免疫反应的基因转录的 关 键 因 素［13］。在 多 数 静 息 细 胞 中，NF-κB 家 族成员与IκB 家族成员共价结合并位于细胞质中［14］。当上述细胞表面的TLRs 识别病原体时，导致IκB家族成员磷酸化和降解，NF-κB 家族成员易位到细胞核并与基因的顺式作用NF-κB 增强子元件结合，促 进 炎 症 介 质，如IL-1β 和IL-6 等 产 生［15］。这些促炎细胞因子作为自分泌正反馈，进一步激活 NF- κB， 随 后 产 生 更 多 的 促 炎 介 质［16］。NF-κB p65 及IκB-α 分别是子宫和输卵管中NF-κB家族和IκB 家族的代表性成员［17］，因此能作为判断NF-κB 通路是否被激活的指标。研究［18］发现：中成药甲连盆腔胶囊能降低血清IL-1β 水平以及子宫组织中NF-κB p65 蛋白表达水平，减轻盆腔炎性疾病后遗症模型大鼠炎症反应。膈下逐瘀汤通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路，降低血清炎症因子水平，改善慢性盆腔炎大鼠血瘀症状［19］。上述研究表明NF-κB 信号通路在中成药治疗妇科炎症中具有重要作用。本研究结果表明：输卵管感染炎症后，发生炎性细胞浸润和NF-κB 信号通路的激活。在大鼠输卵管炎性不孕症模型中，TGXZ 发挥抗炎作用，具有阻断NF-κB 通路激活的潜在机制。该结论与前期的中成药作用效果以及可能的分子机制［19］类似。研究［20］显示：TGXZ 主要成分黄芪在动物实验 中 通 过 抑 制NF-κB 通 路，降 低IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，改善炎症损伤。从中药成分方面侧面验证了TGXZ 改善输卵管炎性不孕症的相关分子机制。

综上所述，TGXZ 能通过抑制NF-κB 通路活化，改善输卵管炎性不孕症大鼠血清炎症因子水平，输卵管组织炎性细胞浸润，并且提高大鼠受孕率，为TGXZ 治疗输卵管炎性不孕症提供基础研究数据。本课题组后续将从其他可能的炎性通路途径探讨TGXZ 的作用机制，丰富中医药治疗的基础研究。