乳双歧杆菌V9对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠的改善作用

钟明月 刘春妍 颜妍 张晓慧 原海升 徐国全 张和平 王玉珍

（1. 内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010011；2. 内蒙古农业大学教育部乳品生物技术与工程重点实验室，呼和浩特 010018）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝脏中过多的脂肪堆积为特征的疾病，肥胖成年人的患病率高达50.7%［1-2］。NAFLD和肥胖、高胰岛素血症、外周胰岛素抵抗、糖尿病、高甘油三酯血症、高血压共同构成代谢性综合征［3］。NAFLD可以从单纯性脂肪肝发展为脂肪性肝炎和肝硬化，最终有可能发展为肝癌，其发病机制是由多因素引起的［4］。

已经建立了几种理论来解释NAFLD的发病机制。人们认识较多的理论是“二次打击假说”［5］。根据这一理论，肝脏在第一次打击后，会对第二次打击更加敏感。随后，“二次打击假说”被认为过于简化的解释了NAFLD的发病机制。其中还可能涉及遗传和表观遗传因素、饮食、生活方式、线粒体功能障碍、轻度慢性炎症、脂肪组织功能障碍、氧化应激和内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、微生物群和组成性免疫。因此，最近提出的“多重打击学说”［6-8］可能更接近NAFLD发病本质。

尽管对NAFLD的研究取得了一定的进展，但针对其治疗策略仍不清楚［9］。“肠肝轴”被认为与NAFLD的发展有关，同时也是探究更安全有效治疗NAFLD的热点。早期研究表明，在ob / ob小鼠中用益生菌（以改善肠道菌群）或抗TNF抗体（以抑制TNF活性）治疗会改善NAFLD［10］。这些研究将肠道微生物与肝胰岛素抵抗、非酒精性脂肪性肝炎信号传导联系起来，表明“肠肝轴”在其中扮演重要角色。乳双歧杆菌V9（Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9）是从12位健康蒙古族儿童粪便分离得到的31株双歧杆菌中筛选出的1株具有良好益生功能的新型潜在益生菌，它显示出对胃酸和胆汁酸的高度耐受性［11］。临床研究表示乳双歧杆菌V9可以增加肠道内双歧杆菌数量，改善肠道菌群平衡，具有抗氧化、降血脂、抑制肥胖、降低甘油三酯和胆固醇表达的作用［12］。本实验以“肠肝轴”为理论基础，探究益生菌 V9 对于NAFLD 大鼠的脂代谢紊乱以及肠道炎症和屏障功能的改善情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6-8周雄性Wistar大鼠40只，体重（120±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，培养条件为（25±2）℃，（60±10）%湿度，12 h/12 h-光照/黑暗交替，并自由获得食物和水。

1.1.2 动物饲料 普通维持饲料和高脂饲料均购自北京科奥协力饲料有限公司，饲料配比如表1所示。

表1 动物饲料配比Table 1 Ratio of animal feed

1.1.3 实验试剂 乳双歧杆菌V9由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验提供；盐酸小檗碱水合物（Berberine）购自阿拉订试剂公司；NEFA、TG的检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，Real-time PCR所用试剂均购自TaKaRa生物公司。

1.2 方法

1.2.1 动物实验模型的构建 适应性饲养两周后，将40只雄性Wistar大鼠随机分为5组（n=8）：空白对照组（Control）、高脂饮食模型组（HFD）、黄连素阳性药物组（Berberine）、乳双歧杆菌V9治疗组（HFD/V9）和乳双歧杆菌V9对照组（V9）。除空白对照组（Control）和乳双歧杆菌V9对照组（V9）给予普通维持饲料外，剩余组分均给予高脂饮食6周构建NAFLD模型。6周后，将高脂饮食替换为普通维持饲料，并按照大鼠体重进行灌胃给药，阳性药物组（Berberine）给药剂量为50 mg/kg，HFD/V9和V9组给药剂量为1×109CFU/mL，空白对照组（Control）和高脂饮食模型组（HFD）给予对应的生理盐水。4周后，禁食不禁水12 h，收集血液、肝脏以及结肠组织用于后续试验检测。本实验经内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会审查批准，伦理批准号为NND2021058。

1.2.2 肝组织脂代谢相关指标检测 大鼠肝脏中非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA）和甘油三酯（triglycerides，TG）水平检测按照南京建成生物工程试剂盒说明书指定方法进行测定。

1.2.3 HE染色观察肝脏组织病理学变化 取部分结肠组织用10%的甲醛溶液固定。将组织依次浸泡在不同梯度的酒精（30%-2 h，40%-2 h，50%-2 h，60%-2 h，70%过夜，80%-2 h，90%-2 h，100%-2 h，100%-2 h）里进行脱水，二甲苯透明（二甲苯 I-10 min，二甲苯 II＜10 min），软蜡浸泡 40 min，硬蜡 I浸泡 1 h，硬蜡 II浸泡 1 h，最后硬蜡包埋。包埋好的石蜡制成切片（5 μm），40℃ 自来水中进行展片，60℃烤片。将组织依次浸泡在二甲苯 I、 II各10 min进行脱蜡，不同酒精梯度（100%-10 min，100%-10 min，95%-10 min，90%-10 min，80%-10 min，100%-10 min）水化，蒸馏水冲洗，苏木精染色，1%盐酸酒精分色，自来水冲洗，0.06%氨水返蓝，伊红快速染色30 s，不同酒精梯度脱水（80%-10 min，90%-10 min，95%-10 min，100%-10 min，100%-10 min），二甲苯 I、 II各10 min，然后用中性树胶封片，室温放置24 h以上，用光学显微镜观察肠组织的变化情况。

1.2.4 Real-time PCR 检测基因 IL-1β、TNF-α、TLR2、TLR9、FAS（fatty acid synthase） 的 mRNA 表 达 水平 Trizol法提取大鼠肝组织的总RNA，测定RNA浓度，要求OD260/280的比值在1.8-2.0之间，将总RNA反转录成cDNA，反应体系为5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL、Total RNA 500 ng，后用 RNase Free dH2O补至10 μL。各基因相对表达量按照公式2-△△ct进行计算，引物序列见表2。

表2 Real-time引物序列Table 2 Primer sequences of real-time PCR

1.2.5 统计学处理 所得数据使用SPSS20.0软件进行统计学差异分析。数据以均值±标准差（）的形成表示，按照Duncan’s多重比较法计算各组数据间显著性差异，当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肝脏脂质代谢的影响

如图1所示，与Control对照组相比，NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量在HFD模型组中显著升高（P＜0.01），V9对照组表达正常；与HFD模型组相比，各指标的含量在Berberine阳性药物组和V9治疗组中显著降低（P＜0.01），说明乳双歧杆菌V9可以改善NAFLD大鼠肝脏脂质代谢异常。

图1 肝脏中NEFA和TG的含量以及FAS和Fabp1的mRNA表达水平Fig.1 Contents of NEFA and TG，and mRNA expression of FAS and Fabp1 in the liver

2.2 乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肠道细胞因子水平的影响

由于肠肝轴的存在，推测肠道中可能存在炎症反应。如图2所示，与Control对照组相比IL-1β和TNF-α的含量在HFD模型组中显著升高（P＜0.01），V9对照组没有明显差异；与HFD模型组相比，IL-1β和TNF-α的含量在Berberine阳性药物组和V9治疗组中显著降低（P＜0.01），说明乳双歧杆菌V9抑制了NAFLD大鼠肠道中炎性反应。

图2 肠道中IL-1β和TNF-α的表达水平Fig. 2 Expressions of IL-1β and TNF-α in the intestine

2.3 乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肠道TLRs的影响

TLRs信号通路的激活促进炎症细胞因子的表达。我们进一步研究V9是否影响肠道TLR受体的表达。如图3所示，与Control对照组相比，TLR2和TLR9的mRNA水平在HFD模型组中显著升高（P＜0.01），V9对照组无显著变化；与HFD模型组相比，TLR2和TLR9的mRNA水平在Berberine阳性药物组和V9治疗组中显著降低（P＜0.01），说明乳双歧杆菌V9在NAFLD大鼠肠道的抗炎反应中起到了重要作用。

图3 肠道中TLR2和TLR9的表达水平Fig. 3 Expressions of TLR2 and TLR9 in the intestine

2.4 乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肠道组织形态的影响

如图4所示，通过H＆E染色观察高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肠道组织的形态学变化，结果显示，在HFD模型组中结肠组织结构无明显的改变。同样在Control对照组、Berberine阳性药物组和V9治疗组，其肠道组织结构均保持一定的完整性。但在乳双歧杆菌V9作用后，肠道组织内出现了大量的菌团，可能是通过调节肠道内菌群数量进而缓解了高脂饮食诱导的NAFLD。

图4 V9对NAFLD大鼠肠道结构的影响Fig. 4 Effects of V9 on the intestine structure in NAFLD rats

2.5 乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肠道黏膜屏障的影响

构成紧密连接重要成分的闭锁小带蛋白1（ZO-1）和紧密连接蛋白（occludin），如图5所示，与Control对照组相比ZO-1和occludin的表达在HFD模型组中显著降低（P＜0.01），V9对照组表达正常；与HFD模型组相比，ZO-1和occludin的表达在V9治疗组中显著升高（P＜0.01），说明乳双歧杆菌V9可以保护肠道屏障的完整性，改善NAFLD大鼠肠道的黏膜屏障功能。

图5 肠道中ZO-1和occludin的表达水平Fig. 5 Expressions of ZO-1 and occludin in the intestine

3 讨论

NAFLD是指在没有引起继发性脂肪堆积（例如过量饮酒）的情况下，肝脏中脂肪过多积聚的一种疾病。近年来，NAFLD患病率逐年上升，目前已经发展成为全球最流行的慢性肝病［13］。NAFLD与较高的心血管疾病（CVD）风险相关，尽管NAFLD在世界范围内的流行程度不断上升，但截止到目前，尚无食品药品监督管理局（FDA）批准的NAFLD治疗药物，当下较热的方法是通过饮食干预和改变生活方式［13-14］。本实验以“肠肝轴”为理论依据，通过高脂饮食诱导NAFLD模型，探究乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠肠道炎症因子表达和黏膜屏障结构的影响。为了观察乳双歧杆菌V9对NAFLD大鼠体内脂质代谢的影响，分别测定了肝脏中的非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）、脂肪酸合成酶（FAS）和脂肪酸结合蛋白1（Fabp1）脂质代谢相关指标。发现NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量在HFD模型组中显著高于对照组，说明HFD模型组脂质代谢紊乱，较易发生脂肪堆积进而转变为脂肪性肝炎，但是乳双歧杆菌V9与Berberine治疗后，NAFLD大鼠体内的脂质代谢紊乱明显得到缓解，说明乳双歧杆菌V9在调节脂质代谢紊乱方面具有一定的作用。

NAFLD的主要治疗目的是减少肝功能损害、肝细胞脂肪沉积和炎症反应。此外，肠道菌群发育与NAFLD的发生密切相关，改善肠道微生物群可以有效缓解NAFLD［15-16］。之前对肝硬化患者进行的一项随机、双盲、安慰剂研究表明，乳酸杆菌GGAT菌株53103（LGG），可以调节全身性炎症，降低内毒素血症和肠道营养不良症，并改善了肠道微生物组与代谢组的联系［17］。本实验通过Real-time PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA水平，发现与HFD模型组相比，IL-1β和TNF-α的含量在Berberine阳性药物组和V9治疗组中显著降低，说明乳双歧杆菌V9有效抑制了NAFLD大鼠肠道中炎性细胞因子的释放，进而减轻了肠道炎症。

已经研究证明，在高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型中，TLRs受体在从脂肪肝变性到脂肪性肝炎的进展中起关键作用。肠道菌群可能通过增加炎性细胞因子分泌，激活TLRs受体以及改变胆汁酸代谢来促进与NAFLD相关的肝硬化和肝癌的发展［18-20］。通过本实验研究发现，乳双歧杆菌V9有效降低了高脂饮食大鼠肠道中的TLR2和TLR9的mRNA水平，从而表现出抗炎活性。

肠道菌群的代谢产物可以通过不同机制影响NAFLD的发生。改变肠道菌群会增加肠道内脂肪酸含量，使肠道通透性增高。进而使内毒素通过门静脉循环进入肝脏，导致炎症反应，从而损伤肝细胞［21］。肠道屏障功能包括了物理、化学、生物和免疫屏障的4个方面，都与NAFLD密切相关［22］。通过检测闭锁小带蛋白1（ZO-1）和紧密连接蛋白（occludin）在肠道内的表达，发现乳双歧杆菌V9可以保护肠道屏障完整并通过调节TLRs受体表达，进而改善NAFLD。关于NAFLD的诊断和治疗，由于发病机制的复杂性而收到多方面限制，所以对于新药物和治疗技术的探索显得尤为重要。本实验研究了乳双歧杆菌V9处理对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠脂代谢、肠道炎症和屏障功能的影响。采用益生菌改善NAFLD的研究较多，不同益生菌的效果和机理差异较大。本研究发现乳双歧杆菌V9效果较好，但仍然需要对乳双歧杆菌V9的活性成分进行进一步鉴定，以便更好地开发利用乳双歧杆菌V9。

4 结论

本实验使用高脂饮食诱导建立大鼠NAFLD模型，通过观察肝脏中脂质代谢相关因子NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量变化，以及肠道中IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR9的含量变化，得出在乳双歧杆菌V9干预下，可以改善NAFLD大鼠的脂质代谢紊乱和肠道炎症。通过观察大鼠肠道组织形态，以及ZO-1和Occludin的含量变化，发现乳双歧杆菌V9可以保护肠道屏障完整。