水稻不育系稻粒黑粉病抗性QTL的定位

杨益善 孙平勇 余木兰

（1. 湖南杂交水稻研究中心，长沙 410125；2. 三亚市国家耐盐碱水稻技术创新中心，三亚 572024）

稻粒黑粉病是由Tilletia horrida引起的一种普遍发生的真菌性病害，也是一种重要的检疫性病害。稻粒黑粉病主要发生于不育系，是杂交水稻繁殖、制种生产中的主要病害之一。我国杂交水稻繁殖、制种一般因稻粒黑粉病减产20%左右，重者可达50%以上，每年因该病导致经济损失10-12亿元［1］。为了提高杂交水稻的制繁种产量，育成的不育系柱头外露率越来越高，稻粒黑粉病发生也呈加重趋势。现在生产上应用的不育系绝大多数不抗稻粒黑粉病［2-3］，主要采用化学药剂防治，不但增加制种成本，而且污染生态环境。发掘抗病基因、选育抗病不育系是防治稻粒黑粉病的绿色环保和高效的方法，对杂交水稻种子生产和种业发展具有重要意义。

稻粒黑粉病于1896年在日本首先发现［4］，其后国内外学者相继对其发病症状、病原菌生物学特性［5-6］、侵染机制［7-8］、影响发病的因素［9-11］以及防治方法［12-16］等开展了研究。稻粒黑粉病由菌丝在水稻开花时从柱头侵染进入子房而发病，病菌在无授粉的条件下就能侵入，但只在胚乳能正常发育的水稻子房中形成冬孢子而表现出黑粉症状［8］。稻粒黑粉病的发病程度存在品种间差异［2-3］，主要取决于水稻开花习性，颖花张开的时间越长、张颖角度越大、柱头外露率越高，越易感染病菌，与柱头外露率、开颖时间呈极显著正相关［17］。另外，适温（28-30℃）高湿环境有利于病菌的繁殖和侵染［18］。

关于水稻对稻粒黑粉病抗性的遗传和基因定位的报道很少。笔者在前期试验中发现水稻光温敏核不育系W9593S稻粒黑粉病发生较轻，而培矮64S稻粒黑粉病发生严重，且二者不育基因均来自农垦58S。于是将二者杂交，构建了重组自交系（RIL）遗传群体，拟探讨水稻对稻粒黑粉病抗性的遗传规律，并定位稻粒黑粉病抗性基因，为基因克隆及建立水稻抗稻粒黑粉病分子育种技术体系打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为光温敏核不育系W9593S（对稻粒黑粉病抗性较强）、光温敏不育系培矮64S（易感稻粒黑粉病、与W9593S不育基因等位）、培矮64S/W9593S高世代RIL群体183个株系。

1.2 方法

1.2.1 定位群体构建 2006年冬以W9593S为父本与培矮64S杂交；2007年夏在长沙种植F1，群体不育，割蔸再生收种；2008年夏在长沙种植F2，群体表现不育，抽穗后割蔸再生，随机取400株收取再生种子或带不育禾蔸至海南繁种。以后每代每个株系随机收取一个不育单株（种子或禾蔸），海南繁种时随机取1株套袋自交，避免串粉混杂，期间注意剔除混杂株系。经多年自交，最后构建了由183个高世代稳定光温敏核不育系组成的RIL遗传群体。

1.2.2 稻粒黑粉病抗性表型鉴定 RIL群体及其亲本的稻粒黑粉病抗性表型鉴定分别于2015年夏在湖南杂交水稻研究中心长沙本部试验基地和2020年夏在湖南杂交水稻研究中心长沙春华试验基地进行。2015年试验田为连续多年的杂交水稻制种田，常年稻粒黑粉病发生较重，田间菌源充足。2020年试验田处于新搬迁试验基地，已开展1年杂交水稻制种，稻粒黑粉病发生较轻。

由于RIL群体均为光温敏核不育系，在育性敏感期高温条件下自交不结实，不利于稻粒黑粉病发病，故表型鉴定田间试验参照杂交水稻制种田间布局模式，在RIL不育系两边栽插恢复系，结合人工赶粉，使RIL不育系能够接受外源花粉而受精结实，为稻粒黑粉病发病提供有利条件。以杂交水稻恢复系R901为父本（提供花粉），RIL不育系及其2个亲本为母本（接受花粉）。父本分3期分别于5月17日、5月24日、6月5日播种，预计始穗期分别为8月12日、8月18日和8月26日，确保可较长时间不间断提供花粉。RIL不育系根据播始历期长短分批播种，将抽穗期安排在8月15-24日，处于父本花期中间。父母本移栽行比3∶8，每期父本插1行，母本每小区插40株（5行×8株），父母本株行距均为20 cm×20 cm。随机区组设计，3次重复。中高肥力管理，防虫不防病，全生育期水层覆盖，确保抽穗扬花期田间处于高湿环境，抽穗扬花期每天人工赶粉2-3次。母本种子成熟后，每小区去除与父本相邻的边行后，在中间取株叶形态一致、有代表性的5株，装袋、挂牌，室内风干考种。考查每株穗数、每穗实粒数（受精粒数）、每穗黑粉病粒数，计算黑粉病粒率（病粒数/实粒数×100%）。将黑粉病粒率作为评价稻粒黑粉病抗性的主要指标，黑粉病粒率越高，对稻粒黑粉病的抗性越弱。由于2020年试验在新基地进行，父母本花期差异较大，加上抽穗扬花期高温干旱，较多不育系结实率很低，严重影响了病粒率结果的准确性，故最终表型数据以2015年结果为准。

1.2.3 分子标记检测 在种子成熟期取样考种的同时，每个不育系在取样的5个单株中选取1个代表性单株，摘取绿叶组织用于提取DNA。分子标记检测委托华智水稻生物技术有限公司进行。利用华智水稻生物技术有限公司与中国农业科学院联合设计的56K水稻SNP基因芯片对亲本培矮64S和W9593S进行全基因组SNP扫描，筛选差异SNP位点，再从差异位点中选取亲本间多态性明显、均匀分布于水稻12条染色体上的200个SNP标记，对RIL群体进行基因型检测。

1.2.4 QTL定位 结合RIL基因型和表型检测结果，采用MAPMAKER 3.0作图软件构建遗传连锁图；采用Windows QTL Cartographer 2.5软件进行复合区间作图分析，确定QTL的位置及其对表型的贡献率和加性效应。将LOD值设置为2.5，检测可能存在的QTL，遵循Mc等［19］提出的原则命名QTL。QTL定位实行分批检测、逐步进行，首批先用160个SNP标记对RIL群体进行基因型分型和初步作图分析，然后根据初步定位结果，在定位的QTL附近逐步加密分子标记，缩小遗传距离，提高定位的精确性。

2 结果

2.1 亲本和RIL群体的稻粒黑粉病抗性

试验田整体发病良好，亲本W9593S的稻粒黑粉病粒率为43.79%，显著低于培矮64S（76.16%）。RIL群体的稻粒黑粉病粒率呈连续分布（图1），变幅为1.74%-99.72%，呈双向超亲分离，平均值为52.97%，略偏于低值亲本，峰度（-0.83）和偏度（0.1）均小于1，说明稻粒黑粉病粒率表现为数量性状遗传，符合QTL定位的要求。

图1 RIL群体的稻粒黑粉病粒率频次分布Fig.1 Frequency distribution of rice kernel smut rate in RIL population

2.2 亲本间遗传多态性

采用CTAB方法分别提取亲本W9593S和培矮64S的DNA，经严格质检，DNA质量符合芯片检测要求。利用水稻56K全基因组SNP芯片对2个亲本进行全基因组SNP扫描，结果显示，芯片扫描共获得34 930个有效SNP位点数据，亲本间差异位点数为13 690个，其中757个差异位点已被华智水稻生物技术有限公司开发成SNP标记，这些标记较为均匀地分布于水稻12条染色体上，第1和第4染色体上的标记数较多，分别为81和80个，第10染色体上的标记数最少，只有47个（图2）。

图2 亲本W9593S、培矮64S间差异SNP标记染色体分布Fig. 2 Chromosome distribution of differential SNP marker between parents W9593S and Pei′ai 64 S

2.3 稻粒黑粉病抗性QTL定位

首先从757个多态性SNP标记中选取均匀分布于水稻12条染色体上的160个标记（每条染色体12-13个），对RIL群体进行初步检测和基因型分型。结果显示，145个标记对RIL群体基因型分型结果良好，9个标记群体多态性差，对基因定位结果无参考价值，6个标记在亲本间无多态性，推测是芯片数据的假阳性位点。

根据145个标记对RIL群体的基因型分型结果，采用MAPMAKER 3.0作图软件构建了遗传连锁图。结合RIL基因型和表型检测结果，采用Windows QTL Cartographer 2.5软件进行复合区间作图分析，初步定位到6个QTL，分布于第1、4、8、10、11、12等6条染色体上，其中第1、8、11染色体上的QTL贡献率较大。于是在第1、8、11染色体上定位的QTL连锁标记两端增加10个标记，进一步进行QTL定位。如此经过连续3次加密分子标记和作图分析，最终定位到5个稻粒黑粉病抗性QTL，分布在第1、4、8、11等4条染色体上，其中在第1染色体上的相近位置定位到2个QTL（图3）。由表1可见，除第11染色体上的qRRKS-11的抗病等位基因来自亲本培矮64S外，其余4个QTL的抗病等位基因均来自亲本W9593S；QTL qRRKS-11和qRRKS-8的表型贡献率较大，分别为13.64%和12.07%。qRRKS-11位于SNP标记K_110403与K_110016之间，2个标记之间的遗传距离为0.9 cM；qRRKS-8位于SNP标记K_080131与K_080138之间，2个标记之间的遗传距离为1.4 cM。利用第1批145个标记在第10、12染色体上定位到的2个QTL由于贡献率较小，在多次加密分子标记后，其效应不再显著，最终没有被检测到。

表1 稻粒黑粉病抗性QTL的定位结果Table 1 Mapping results of QTL for resistance to rice kernel smut

图3 稻粒黑粉病抗性QTL在染色体上的分布Fig. 3 Chromosome distribution of QTL for resistance to rice kernel smut

3 讨论

虽然稻粒黑粉病是杂交水稻繁殖、制种生产中的主要病害之一，但却少见有关水稻对稻粒黑粉病抗性遗传和基因定位的报道，难以构建遗传群体可能是其主要原因。稻粒黑粉病主要发生于不育系，三系不育系不能自交结实，无法构建稳定的遗传群体；只有不育基因等位的光温敏不育系杂交，才能构建稳定的不育系遗传群体。本研究供试亲本W9593S对稻粒黑粉病抗性较强，培矮64S易感稻粒黑粉病［2］，且与W9593S不育基因等位，杂交F1、F2分离群体及后续世代均为光温敏不育株，每个世代可随机收取不育单株（长沙割蔸再生收种或带禾蔸去海南繁殖收种），从而构建稳定的重组自交系遗传群体。由于光温敏不育系自交结实率受育性敏感期气温影响而不稳定，当自交结实率低时容易串粉混杂，虽然F2收获400个单株，但在逐年淘汰混杂株系后，最终构建的定位群体只保留了183个株系。

前人对稻粒黑粉病的表型鉴定大多是在田间自然条件下鉴定［2，17］，也有极少数研究进行田间注射接种鉴定［3］，前者工作量较小，但发病程度易受环境影响，后者鉴定结果更准确，但接种工作量大。稻粒黑粉病的发病程度受品种特性和环境条件的双重影响，适温（28-30℃）高湿环境有利于病菌的繁殖和侵染［18］。本研究采用的表型鉴定方法是田间自然条件下鉴定。2015年表型鉴定试验田间温湿度适宜，父母本群体花期相遇良好，外源花粉量较充足，促进了RIL群体稻粒黑粉病的充分发病，亲本W9593S和培矮64S的稻粒黑粉病粒率分别为43.79%和76.16%，远高于宗寿余等［2］的调查结果（1.98%和12.53%），说明2015年试验的表型调查结果能较准确地反映RIL群体的基因型差异。

为了提高杂交水稻的制繁种产量，生产上应用的不育系柱头外露率越来越高，稻粒黑粉病发生也呈加重趋势。虽然育种家们致力于抗病不育系的选育，但至今未取得突破性的进展，稻粒黑粉病抗性育种任重而道远。本研究定位了5个稻粒黑粉病抗性QTL，其中 qRRKS-11和qRRKS-8对提高稻粒黑粉病抗性的贡献率较大（分别为13.64%和12.07%），定位区间小（遗传距离分别为0.9和1.4 cM），为进一步开展基因精细定位和克隆以及分子标记辅助育种打下了基础。此外，供试RIL中，有7个不育系的病粒率低于20%，均极显著低于抗病亲本W9593S，其中，不育系S065病粒率仅为1.74%，该不育系同时携带qRRKS-1.2、qRRKS-4、qRRKS-8、qRRKS-11等4个抗稻粒黑粉病QTL，可直接用于选配杂交水稻新组合，也能作为抗源在稻粒黑粉病抗性育种中发挥重要作用。

4 结论

水稻对稻粒黑粉病的抗性表现为数量性状遗传。利用培矮64S/W9593S的重组自交系遗传群体，通过复合区间作图定位了5个稻粒黑粉病抗性QTL，这5个QTL分布在4条染色体上，表型贡献率为7.26%-13.64%，其中qRRKS-11和qRRKS-8的表型贡献率较大，分别为13.64%和12.07%，定位区间的遗传距离分别为0.9和1.4 cM。qRRKS-11和qRRKS-8效应较大，通过进一步精细定位和克隆，可以用于抗稻粒黑粉病不育系的分子标记辅助育种。

致谢：

湖南农业大学张桂莲教授、廖斌和蔡志欢先生参与了部分研究工作，特此致谢。