茉莉花萜类合成酶基因的转录组鉴定及响应外源激素的表达研究

洪雅萍 陈雪津 王鹏杰 谷梦雅 高婷 叶乃兴

（福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州 350002）

茉莉花［Jasminum sambac（L.）Ait］属于木犀科（Oleaceae）素馨属植物，是一种典型的气质花，其香气随着花朵的盛开而逐渐释放［1］。香气是评价茉莉花品质优劣的重要指标之一，萜类化合物是其香气的重要组成部分，根据萜类化合物中异戊二烯（isoprene，C5）的单元数量的不同，可分为单萜（monoterpene，C10）、倍半萜（sesquiterpene，C15）、二 萜（diterpene，C20）、 三 萜（triterpenes，C30）、四萜（tetraterpenes，C40）及多萜（polyterpenes）等［2］。植物花香中最常见的单萜和倍半萜是具有挥发性或香气物质的小分子化合物，如：柠檬烯、芳樟醇、月桂烯、石竹烯、法尼烯等［3］。萜类化合物是茉莉花香气中占比最大的一类挥发性化合物，含有芳樟醇、法尼烯、橙花叔醇和石竹烯等［4］。

萜类合成酶（terpenoid synthase，TPS）是萜类化合物合成中下游的关键酶，萜类合成酶种类和功能的多样性构成了复杂的TPS基因家族及多样的萜类化合物。萜类化合物可以通过位于细胞质的甲羟戊酸（MVA）途径和位于质体的甲基赤藓糖磷酸（MEP）途径合成，萜类合成酶利用两条途径生成的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）作为合成前体，从而合成多种多样的萜类化合物［3］。根据萜类合成酶氨基酸序列40%同源性作为区分标准，可将其划分为7个亚家族为TPS-a～TPS-g，被子植物中的萜类合成酶主要分布于TPS-a、TPS-b 及 TPS-g，TPS-c是最原始的亚家族［5］；TPS-g为最后发现的亚家族［6］；TPS-e及TPS-f合称为 TPS-e/f。近年来，已在拟南芥［7］、番茄［8］、茶树［9］、水稻［10］等物种中对TPS基因家族进行了系统的研究，在姜花［11］、茶树［12］和艾草［13］等物种中克隆得到TPS基因，此外，前期课题组也通过克隆得到茉莉花TPS基因［14］。萜类合成酶在植物组织中存在特异表达，陈雪津等［15］在茶树中筛选出16个萜类合成代表基因分别在顶芽和嫩叶中高表达，程甜等［16］在中粒咖啡TPS家族中发现20个基因仅在特定组织中表达。植物TPS基因的表达会受到外源激素的影响，茉莉花JsNES/LINS基因会受多种外源激素不同程度的诱导［17］；孟崔颖［18］使用5种不同的外源激素处理丹参植株，发现其中SA会使4个丹参TPS基因显著下调表达；姜黄C-HMGR与C-FPS基因的表达量均可被IAA、ABA、SA、GA诱导上调表达［19］。迄今为止，对茉莉花TPS基因家族系统的鉴定和表达模式分析未见报道。

为了更加全面地了解茉莉花TPS基因家族的信息，本研究利用前期课题组的转录组数据，从中筛选出茉莉花TPS基因序列，利用生物信息学方法，对茉莉花TPS基因家族进行了系统的鉴定及分析；采用实时荧光定量技术，探究该家族基因在茉莉花不同组织中及不同激素处理下的表达模式。为今后探索茉莉花TPS基因家族的功能及外源激素胁迫下的作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

双瓣茉莉花取自福建农林大学茉莉花种质资源圃。在自然生长状态下，取茉莉花的根、茎、叶、花蕾和花瓣等不同组织，作为茉莉花TPS家族基因组织表达分析的材料。采用100 μmol/L的IAA（生长素）、30 μmol/L 的 GA（赤霉素）、1 000 μmol/L 的SA（水杨酸）和100 μmol/L的 MeJA（茉莉酸甲酯）等不同激素分别处理茉莉花植株，具体浓度设置参照前人［17，20］的方法 ；取处理 0、2、4、6、9和 12 h后的茉莉花瓣，作为茉莉花TPS家族对不同激素表达响应研究的材料。以上材料设3次重复，用锡箔纸包裹、液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱用于后续的RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 茉莉花TPS基因家族成员的鉴定 本研究基于课题组前期获得的茉莉花转录组测序数据［21］，对茉莉花中的萜类合成酶基因进行鉴定。从Pfam（http://pfam.xfam.org）数据库下载含有TPS基因家族的特征结构域PF01397和PF03936的隐马尔可夫模型，以此作为种子序列进行比对，并利用HMMER软件及 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）网站鉴定，确认候选序列是否具有完整的TPS特征结构域，即Terpene_synthase（PF01397）和Terpene_synthase_C（PF03936），经校对后留下同时具有两个特征结构域的序列。在ExPASy（https://www.expasy.org）网站对茉莉花TPS蛋白进行理化性质分析。利用在线网站WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）进行亚细胞定位预测。在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）网站对茉莉花TPS基因进行功能预测。

1.2.2 茉莉花TPS基因家族系统进化树构建及序列比对分析 根据拟南芥、番茄和茶树关于TPS基因的相关文献［7-9］整理基因登录号，随后从TAIR（https://www.arabidopsis.org/）、SOL（http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome）和TPIA（http://tpia.teaplant.org/）数据库下载对应序列，均保留原文献命名方式；从NCBI蛋白数据库下载油橄榄和桂花的TPS基因家族成员序列。将拟南芥、番茄、茶树、油橄榄和桂花的蛋白序列与茉莉花TPS蛋白序列共同使用MEGA7.0软件，以邻接法构建系统进化树，Bootstrap值设置为1 000［22］。为预测茉莉花TPS家族结构，采用DNAMAN7.0软件和Web Logo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）在线软件分析茉莉花TPS家族的保守序列。

1.2.3 茉莉花TPS保守基序分析 茉莉花TPS蛋白序列利用MEME在线软件（http://meme-suit.org/tools/meme）对茉莉花TPS蛋白序列进行保守基序预测，基序最大的数目设置为13，其余为默认［23］。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 分别提取上述处理的茉莉花瓣的总RNA，RNA用逆转录试剂盒（TaKaRa）反转录成cDNA作为模板。茉莉花Actin基因作为内参，以茉莉花TPS家族基因的CDS序列在Primer3 Plus在线网站（http://www.primer3plus.com/）进行引物设计（表1）。通过Bio-Rad的CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应，反应体系使用Transstart® Tip Green qPCR superMix试剂盒的方法，程序为94℃，30 s；94℃，5 s；60℃，30 s，40个循环。利用2-△△Ct算法计算基因的相对表达量。不同组织的相对表达量进行归一化处理并使用TBtools软件制作热图，使用SPSS17.0软件进行差异显著性分析（P＜0.05），然后在Prism8软件中制作柱状图。

2 结果

2.1 JsTPS基因家族的鉴定及序列分析

本研究基于课题组前期获得的茉莉花转录组测序数据，于Pfam数据库中下载PF01397和PF03936的隐马尔可夫模型作为种子序列进行比对，并通过HAMMER和SMART网站进行鉴定，最终获得8条同时具有PF01397和PF03936结构域的蛋白序列，分别命名为JsTPS1-JsTPS8（表2）。通过蛋白理化性质分析发现，JsTPS家族成员的蛋白长度在163-844个氨基酸范围内；分子量在19 103.6-96 887.4 kD之间；等电点在5.18-6.09之间，为酸性蛋白；茉莉花TPS成员平均亲水性均为负值，属于疏水性蛋白；亚细胞定位分析结果表明，JsTPS1、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS6定位于叶绿体，JsTPS2、JsTPS5和JsTPS7定位于细胞质，JsTPS8未预测出。在NCBI对茉莉花JsTPS基因进行手动功能注释，依此推测JsTPS1、JsTPS5和JsTPS7分别是大根香叶烯D合酶、α-法尼烯合酶和（E，E）-香叶基芳樟醇合酶。

表2 茉莉花JsTPS基因家族的序列特征Table 2 Sequence characteristics of JsTPS genes in J. sambac

2.2 JsTPS家族系统进化树及序列比对分析

为了探索茉莉花TPS家族的分子系统进化关系，将茉莉花与拟南芥、番茄、茶树、油橄榄和桂花的TPS家族蛋白序列构建系统进化树（图1）。本研究中TPS家族可分为5个亚家族。茉莉花TPS家族 分 布 在 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f和 TPS-g这 4个亚家族，TPS-c亚家族中不含茉莉花TPS家族成员。其中TPS-b亚家族是茉莉花TPS家族最大的亚家 族， 包 含 JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和 JsTPS5；TPS-a、TPS-e/f和 TPS-g分别包含 JsTPS1、JsTPS7和JsTPS6。

图1 茉莉花与其他植物TPS蛋白的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the TPS proteins in the J. sambac and other plants

对茉莉花TPS蛋白序列的进行序列比对及保守性logo分析（图2），结果发现仅JsTPS1、JsTPS2和JsTPS5含有完整的位于N端的双精氨酸残基RRX8W序 列，JsTPS3、JsTPS4、JsTPS6和JsTPS7中RRX8W序列发生了不同程度的变化，JsTPS8中没有发现该序列，说明RRX8W序列的保守性较差。RXR序列在JsTPS6和JsTPS7中发生了变化，表明其保守性也不高。除JsTPS8外，其余茉莉花TPS家族成员中均发现位于C端的富含天冬氨酸残基的DDXXD和NSE/DTE保守序列，说明这两个序列的保守性较高。

图2 茉莉花TPS中RRX8W、RXR、DDXXD及NSE/DTE保守序列的比对Fig. 2 Alignment of the RRX8W，RXR，DDXXD and NSE/DTE conserved sequence among J. sambac TPS

2.3 JsTPS家族的保守基序分析

使用MEME在线网站对茉莉花TPS蛋白进行保守基序预测，检测到13个保守基序（图3）。TPS-b中的JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS5包含全部基序，但JsTPS8只含基序2、7、8和9；TPS-a中的JsTPS1仅缺少基序12；TPS-g中的JsTPS6仅缺少基序4；TPS-e/f中JsTPS7缺少5个基序，分别是基序2、3、5、10和12。同时发现基序7、8、9在茉莉花TPS家族中高度保守，存在于所有茉莉花TPS家族成员中，提示这3个基序在茉莉花TPS家族中具有重要作用。此外，亚家族中的保守基序不尽相同，说明茉莉花TPS家族成员在进化和功能上的差异可能与亚家族的差异有关。

图3 茉莉花TPS家族保守基序分析Fig. 3 Conservative motif analysis of TPS family in J. sambac

2.4 JsTPS基因在不同组织下的表达模式

采用实时荧光定量PCR技术检测茉莉花植株的根、茎、叶、花蕾及成熟花等不同组织中茉莉花TPS家族成员的相对表达量（图4），结果表明，JsTPS4和JsTPS8不表达，其余6个茉莉花TPS家族成员均检测到表达。茉莉花TPS家族中JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5和JsTPS7在花瓣中表达均高于其他组织，JsTPS6在花蕾中表达较高，表明茉莉花TPS可能在茉莉花的开放时具有重要作用。总体上，茉莉花TPS家族基因在茉莉花花瓣上表达量极高，在根、茎、叶和花蕾中低表达。

图4 茉莉花JsTPS家族在不同组织的表达谱Fig.4 Expression patterns of J. sambac JsTPS family in different tissues

2.5 JsTPS基因家族在4种激素处理下的表达模式

采用实时荧光定量PCR技术分别测定喷施IAA、GA、SA和MeJA后不同时间（0、2、4、6、9和12 h）茉莉花TPS家族成员的相对表达量（图5）。结果表明，JsTPS4和JsTPS8不表达，其余6个茉莉花TPS成员均检测到表达。在IAA处理中，6个茉莉花TPS基因均被诱导上调表达，峰值分别约为0 h的5、7、84、50、3和181倍；其中JsTPS7的表达量最高并于6 h出现峰值，与JsTPS1、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7都呈先上升后下降趋势；此外，JsTPS2无明显表达趋势，JsTPS3呈上调表达；说明IAA对茉莉花TPS的诱导作用不同。在GA处理下，JsTPS3的表达量最大，于12 h达到峰值约为0 h的106倍；JsTPS1和JsTPS2的表达量呈下调趋势，表明GA可能会抑制它们的表达。在SA处理下，JsTPS1、JsTPS2及JsTPS6的表达量呈现下调趋势，说明这些基因可能受到SA的胁迫作用；JsTPS3表达量最高，于9 h时达到峰值约为0 h的9倍。在MeJA处理下，6个茉莉花TPS基因均可被显著诱导上调表达，最大值出现在4-9 h间，峰值分别约为0 h的11、52、35、190、18及74倍，其中JsTPS5基因的表达量最高。总体上，MeJA可显著诱导茉莉花TPS家族成员的表达，IAA次之，GA和SA会抑制部分茉莉花TPS基因的表达。

图5 茉莉花JsTPS在不同激素处理下的表达模式Fig.5 Expression analysis of JsTPS under different treatments of IAA，GA，SA and MeJA

3 讨论

萜类化合物作为植物香气中重要的挥发性化合物之一，距今已发现5万多种萜类化合物［1］，萜类合成酶是参与萜类化合物合成的关键酶。本研究通过茉莉花转录组数据并利用生物信息学方法，对茉莉花萜类合成酶基因进行了系统的鉴定，得到8条同时具有Terpene_synthase和Terpene_synthase_C特征结构域的茉莉花TPS基因。通过构建系统进化树，发现茉莉花TPS家族成员可分为4个亚家族，分别为 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f及 TPS-g，与毛竹 TPS家族的分类结果一致［24］；TPS-a亚家族中茶树TPS基因均预测是大根香叶烯D合酶［9］，JsTPS1和它们处在一个亚家族，推测同为大根香叶烯D合酶，且与在NCBI上的预测结果一致。此外，番茄的TPS37和TPS39的功能已知，编码产物均为芳樟醇或橙花叔醇［8］，JsTPS6与这2个基因同源性高，据此推测JsTPS6的功能与TPS37或TPS39的功能相似。序列比对分析发现茉莉花TPS家族含有4段富有功能的保守序列，RRX8W和RXR序列的保守性较差，DDXXD及NSE/DTE序列的保守性较高；其中双精氨酸残基RRX8W序列的缺失会导致单萜合酶无法产生环状单帖产物［6］；DDXXD序列被认为是结合二价金属离子的活性位点，在引导二价异戊二烯基二磷酸底物的催化中起重要作用［25］。

植物的萜类合成酶基因在组织中存在特异性表达，例如毛竹TPS基因家族中PeTPS2的表达量在早、晚花期中最高，PeTPS1的表达量在叶中最高［24］；棉花中GhTPS1和GhTPS3在果皮中的表达量最高，在子叶中最低，在花瓣中却没有检测到［26］。俞滢等［14］利用荧光定量 PCR 技术检测JsTPS在茉莉花开放过程中的表达量变化，发现在花朵未开放时即花蕾时期JsTPS表达量最低，在半开放时最高，并推测JsTPS基因的表达量与茉莉花香气形成有关。本研究中 JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5及 JsTPS7在花瓣中高表达，总体上在根、茎、叶和花蕾中低表达，与俞滢等［14］的结果大体一致，推测JsTPS家族基因对茉莉花香气的形成有重要作用，同时也为茉莉花为“气质花”提供基因角度上的支持。

生长素、赤霉素、水杨酸及茉莉酸甲酯等外源激素可单独或通过协同作用参与调控植物的生长发育过程［27］，茉莉酸甲酯还可以影响植物芳香化合物的合成［28-30］。崔孟颖［18］使用适宜浓度的5种外源激素处理丹参4 h，发现不同激素处理对4个丹参TPS基因诱导程度不同，ABA可以使YL-1的表达量上调，ETH和ABA会使YL-4、YL-5及YL-6上调表达，SA使YL-4、YL-5及YL-6下调表达。陈笛等［17］使用不同激素处理茉莉花植株，发现IAA、GA、MeJA和ABA等激素可不同程度诱导JsNEL/LINS基因的表达。本研究中利用IAA、GA、SA及MeJA等不同激素处理茉莉花植株，发现4种激素均可诱导 JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7不同程度的表达，诱导作用从大到小分别是 MeJA＞IAA＞GA＞SA，GA和 SA会抑制部分茉莉花TPS基因表达，IAA和MeJA可显著诱导茉莉花TPS基因的上调表达，表明外源激素可诱导茉莉花TPS基因的表达，从而催化萜类化合物的合成。此外，JsTPS3在各激素处理下表达量都较高，暗示着JsTPS3可能可响应大部分激素的诱导；茉莉酸甲酯会显著诱导植物中的萜类化合物的产生和积累，王力［31］使用茉莉酸甲酯处理茶叶鲜叶，发现茉莉酸甲酯会使茶鲜叶中萜类化合物相对含量的提高，如α-毕澄茄油烯、石竹烯和α-法尼烯等香气成分。本研究中6个茉莉花TPS基因均能被MeJA显著诱导上调表达，表明MeJA在诱导茉莉花TPS家族成员合成萜类化合物中作用显著。

4 结论

本研究基于茉莉花转录组数据对茉莉花TPS基因进行鉴定，得到8条同时具有两个特征结构域的茉莉花TPS基因，茉莉花TPS家族基因主要在花瓣中高表达且与茉莉花香气形成关系密切，还能够被IAA和MeJA诱导上调表达，GA和SA可能会抑制部分茉莉花TPS基因的表达。