三七细胞中共超表达FPS、SS对皂苷合成的影响

杨延 于龙凤 王绍梅 李卫娜 葛锋

（1. 滇西科技师范学院，临沧 677000；2. 西京学院，西安 710000；3. 昆明理工大学，昆明 650500）

三七［Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen］，又名田七、金不换、人参三七、血参、山漆等，是我国特有的五加科（Araliaceae）人参属（Panax）药用植物。三七在我国用于治疗疾病（尤其是跌打损伤类疾病）已有600余年历史，蜚声中外的“片仔癀”、“云南白药”等均含有三七。三七中的总皂苷是其主要药效组分，研究显示，三七总皂苷对于抗氧化［1］、降血脂［2］、抗肿瘤［3］、降血糖［4］及抗炎［5］等均表现出较好疗效。然而，三七中所含总皂苷量偏低，如何采取有效措施增加三七中的皂苷量是目前关于三七的研究热点之一。三七需较特殊的生长环境，因此其种植区域较为局限，加之其生长周期长（一般需3-5年）、需轮作种植、种植过程存在品种退化和农药、重金属残留超标等问题使得通过人工大规模种植三七以提取获得大量总皂苷的路径受阻。此外，三七总皂苷的组成成分较为复杂，使得人工化学合成手段面临合成工艺繁杂、生产成本偏高以及污染环境等诸多难题。鉴于此，有研究者转而借助生物技术深入探索三七总皂苷的生物合成途径，试图通过寻找途径当中的若干个关键限速酶，克隆并超表达这些酶的编码基因，最终提高皂苷产量［6-8］。截止目前，本课题组已完成对三七皂苷生物合成途径中FPS和SS基因的功能探索，证实两者均为途径中的关键限速酶编码基因［9-10］。本研究在此基础上，通过在三七细胞内共超表达FPS和SS基因，探究两基因在皂苷合成途径当中的联合调控效应，为未来三七皂苷的同源或者异源合成体系的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株及载体 植物材料：未转基因三七细胞（由子叶诱导获得）、转SS三七细胞均为本实验室所保藏。

菌株：Trans1-T1购自北京Transgen公司，Agrobacterium tumefaciens EHA105为本实验室所保藏。

载体：pGEM-T Easy Vector购自美国Promega公司，pCAMBIA1300S为本实验室所保藏。

1.1.2 主要试剂 酶：Ex Taq/Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Kpn I、Xba I限制性内切酶均购自日本TaKaRa公司。

抗 生 素 ：Cefotaxime Na Salt（Cef）、Ampicillin（Amp）、Kanamycin（Kan）均购自安徽Biosharp公司，Hygromycin B（Hyg B）购自上海Sangon公司，Rifampicin（Rif）购自美国Sigma公司。

试剂盒：质粒抽提、胶回收试剂盒均购自上海Sangon公司，GoTaq® 2-Step RT-qPCR System试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 三七总RNA的提取及cDNA的合成 利用部分步骤稍经改良的异硫氰酸胍提取法［11］提取0.2 g未转基因细胞中的总RNA，并以此为模版，以Oligo（dT）15为引物，经M-MLV催化合成第一链cDNA。

1.2.2 三七FPS基因编码区序列的克隆 根据GenBank中发布的三七FPS基因编码区序列（KC953034.1）及pCAMBIA1300S载体上的酶切位点设计一对特异性引物，上游引物为FPSf：5′-GG TACCAGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3′，下游引物 为 FPSr：5′- TCTAGAACAGACAACAACTTCCCC TCCAT-3′。以1.2.1步骤合成的cDNA为模板，进行PCR 反应（50.0 μL），条件为 ：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，32 个循环 ；72℃ 15 min。胶回收PCR产物，将回收物连接至pGEM-T Easy Vector上，后转化Trans1-T1细胞，经LB平板（Amp，100 mg/L）筛选培养后，挑选菌液PCR为阳性的单克隆进行测序鉴定。将测序结果与GenBank中发布的KC953034.1序列进行比对。

1.2.3 pCAMBIA1300S-FPS超表达载体的构建 利用Xba I、Kpn I同时双酶切pGEM-FPS和pCAMBIA1300S，通过T4DNA连接酶将对应的酶切片段连接，连接物转化Trans1-T1细胞，经LB平板（Kan，50 mg/L）筛选培养之后，挑取菌液PCR为阳性的单克隆再次进行质粒双酶切确认。

1.2.4 pCAMBIA1300S-FPS超表达载体的遗传转化 将pCAMBIA1300S-FPS借助CaCl2冻融法导入农杆菌EHA105感受态细胞内，以获得目标菌株EHA105-pCAMBIA1300S-FPS。将已转SS的三七细胞（为本实验保藏）置于预培养基（配方详见表1，下同）上，避光培养3 d。收集经预培养后的三七细胞，将该细胞浸泡于A600为0.6-0.8的EHA105-pCAMBIA1300S-FPS菌液中进行侵染，侵染过程保持温度28℃，转速100 r/min，侵染时间持续15 min。收集经过浸泡侵染的三七细胞并将其表面附着菌液吸干，之后将该细胞置于共培养基上，避光培养3 d。用添加了400 mg/L Cef的高温灭菌蒸馏水洗涤经共培养后的三七细胞，次数3-5次。经过洗涤的细胞在除菌培养基上避光培养14 d。将经过除菌培养后存活下来的细胞转移至筛选培养基上，避光筛选培养若干代，每代培养周期约35-50 d，大约筛选5-7代。

表1 三七细胞培养基配方Table 1 Formulas of P. notoginseng culture media

1.2.5 转FPS、SS阳性细胞系的基因组PCR筛选 根据pCAMBIA2300S-SS载体（存在于转SS细胞中）和pCAMBIA1300S-FPS载体上分别含有的npt II和hpt II筛选标记基因序列设计两对特异引物（表 2）。

表2 基因组PCR引物序列Table 2 Primers used for genomic PCR

提取1.2.4步骤筛选到的转基因细胞基因组DNA，将此作为模版，同时利用表2所示引物进行npt II和 hpt II筛选标记基因 PCR 扩增（20.0 μL），从而鉴别筛选到的细胞是否已成功转入pCAMBIA2300S-SS和pCAMBIA1300S-FPS载体。PCR条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，32个循环；72℃ 15 min。

1.2.6 转FPS、SS阳性细胞系中两基因相对表达量的qRT-PCR检测 按前述方法提取基因组PCR检测结果为阳性的转基因三七细胞总RNA，依照GoTaq®2-Step RT-qPCR System试剂盒说明书进行qRT-PCR扩增（20.0 μL），反应以GAPDH为内参基因，所用引物序列详见表3，反应条件为：95℃ 2 min；95℃15 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共 40 个循环。

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primers used for qRT-PCR

1.2.7 转FPS、SS阳性细胞系中总皂苷及部分单体含量的测定 各称取0.1 g未转基因、仅转SS以及同时转FPS、SS三七细胞粉末至离心管中，往管中各加入10 mL 70%甲醇溶液浸泡过夜。对浸泡后细胞液进行常温超声波提取60 min。提取结束后，将过滤获得的细胞液50℃烘干至恒量。加10 mL无菌水溶解烘干残余物，接着再用水饱和正丁醇萃取3次，每次用量约10 mL，合并3次萃取液并将其50℃烘干至恒量。加适量甲醇溶液溶解烘干残余物，最终将该溶液定容至5 mL，经0.45 μm滤膜过滤后，最终所得滤液即为三七细胞皂苷溶液。

采用香草醛-高氯酸-冰醋酸分光光度法［12］测定未转基因、仅转SS以及同时转FPS、SS三七细胞皂苷溶液中的总皂苷量。采用HPLC法测定Rh1、Rg1、Re、Rd、Rb1五种重要单体皂苷量，具体操作如下：精确称量适量的Rh1、Rg1、Re、Rd、Rb1单体皂苷标准品，将各标准品混合并加1 mL甲醇使其完全溶解，获得的混合溶液即为混合皂苷标准品溶液。分别移取4、6、8、10、15、20、25、30 mL混合标准液，将其注入HPLC仪中进行检测，检测条件为：色谱柱 Waters Symmetry C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱温 35℃；流动相 乙腈和水，乙腈∶水梯度洗脱（V/V）顺序见表4；进样量 20 μL，流速 1.0 mL/min；检测波长 203 nm。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制各单体皂苷的标准曲线及获得相应的线性回归方程。取20 μL经上述操作步骤获得的三七细胞皂苷溶液，将其注入HPLC仪中进行检测。

表4 乙腈∶水梯度洗脱表Table 4 Elution gradient of acetonitrile to water

2 结果

2.1 三七FPS基因编码区序列的克隆及pCAMBIA-1300S-FPS超表达载体的构建与鉴定

将未转基因三七细胞总RNA作扩增模板，经RT-PCR反应后克隆到一条约1 200 bp的基因序列，符合预期大小。将该序列测序后与GenBank中的KC953034.1序列作比对，测序结果与KC953034.1序列完全一致。

将测序无误的FPS编码区序列与线状pCAMBIA1300S（8 959 bp）连接，双酶切连接得到的重组载体，酶切产物经电泳产生两条约9 000 bp和1 200 bp的DNA片段，符合预期大小，表明pCAMBIA1300S-FPS超表达载体已被成功构建。

2.2 转FPS、SS阳性细胞系的基因组PCR筛选

双抗生素（Kan和Hyg B）筛选5轮后，获得了7株转双基因细胞。由于pCAMBIA2300S-SS载体和pCAMBIA1300S-FPS载体上分别含有npt II和hpt II筛选标记基因，pCAMBIA2300S-SS载体上的外源SS基因与npt II基因位于同一T-DNA中，pCAMBIA1300S-FPS载体上的外源FPS基因同样与hpt II基因位于同一T-DNA中，因此，以各转双基因细胞系的基因组DNA作为模板，通过对npt II和hpt II筛选标记基因进行基因组PCR分析，就可间接确认外源SS基因和FPS基因是否已成功与三七细胞基因组整合。转双基因细胞基因组PCR结果见图1和图2。由两图可知，从7株细胞基因组中都克隆到两条长度均为450 bp左右的npt II和hpt II筛选标记基因片段，符合预期大小，证实pCAMBIA2300SSS和pCAMBIA1300S-FPS已被转入7株三七细胞中。

图1 转基因细胞系中npt II基因的基因组PCR检测Fig. 1 Genomic PCR detection of npt II in transgenic cell lines

图2 转基因细胞系中hpt II基因的基因组PCR检测Fig. 2 Genomic PCR detection of hpt II in transgenic cell lines

2.3 转FPS、SS阳性细胞系中两基因相对表达量的qRT-PCR检测及皂苷含量的测定

双抗生素筛选5轮后获得的7株细胞中，有3株因生长速度过慢而无法进行后续检测，顾被弃之，留剩余4株细胞，并对其进行编号，编号依次为T-1，T-2，T-3，T-4（图 3）。

图3 三七细胞Fig. 3 P. notoginseng cells

对4株细胞进行qRT-PCR分析。结果显示，FPS，SS及GAPDH基因的扩增效率均在有效统计范围之内；溶解曲线有单一峰，综合表明qRT-PCR反应无非特异性扩增干扰。

T-1、T-2、T-3、T-4、未转基因细胞及仅转SS细胞中的FPS和SS基因表达差异见图4。

图4 三七细胞中FPS和SS基因的相对表达量Fig. 4 Relative transcription levels of FPS and SS in P. notoginseng cells

根据图4知，在4株转FPS、SS细胞中，FPS的相对表达量均比两对照（未转基因细胞和仅转SS细胞）高，最高分别是未转基因对照的3.26倍和仅转SS对照的3.74倍；SS的相对表达量与仅转SS对照相比无显著差异，但均比未转基因对照高。

T-1、T-2、T-3、T-4、未转基因细胞及仅转SS细胞中的总皂苷和部分单体皂苷含量测定结果如图5和图6所示。

图5 三七细胞中总皂苷含量Fig. 5 Contents of PNS in P. notoginseng cells

图6 三七细胞中部分单体皂苷含量Fig. 6 Contents of monomer saponins in P. notoginseng cells

根据图5可知，以未转基因及仅转SS三七细胞为对照，4株转双基因阳性细胞中的总皂苷量均有不同幅度增加，其中，T-2中总皂苷量最高，为64.48 mg/g干重，分别是未转基因对照的2.46倍和仅转SS对照的1.73倍；T-1中的总皂苷量次之，为58.86 mg/g干重，分别为未转基因对照的2.26倍和仅转SS对照的1.63倍。

由图6可知，从4株转双基因阳性细胞中均可检测到单体皂苷：Re、Rb1、Rh1、Rd和Rg1，且对比未转基因对照，仅T-3中的Rb1含量出现下降趋势，其余细胞中的上述5种单体皂苷量均呈现出不同程度的增幅，其中以Re的增幅最为显著。

3 讨论

FPS被普遍认为是植物三萜皂苷合成途径中的一个关键酶，由FPS催化生成的产物——法呢基焦磷酸可同时为倍半萜等及三萜皂苷提供合成前体（图7）。目前，有关FPS基因功能的研究较多，并取得了一些成果：杨林林等［13］研究发现，在与三七亲缘关系较近的人参根中，FPS的相对表达量与人参皂苷Rb3的积累量呈显著正相关。Kim等［14］向人参发根中导入人参FPS基因超表达载体，实现了人参发根细胞中FPS的超表达，同时使得人参皂苷的含量也得到显著提升，最高可达到野生型对照的3倍以上。刘美佳等［15］向与三七同属的珠子参细胞中转入珠子参FPS基因超表达载体，同样使得珠子参细胞中的FPS相对表达量及三萜皂苷含量显著提高，最高为未转基因对照的3倍。本课题组前期构建了三七FPS基因超表达载体并将其转入三七细胞内，结果显示，转基因三七细胞中的FPS均得到超表达，且细胞中的总皂苷量和部分单体皂苷量均高于未转基因对照，总皂苷量最高为对照的2.09倍［9］。SS被认为是植物三萜皂苷合成途径中的又一个关键酶，由其催化生成的产物——鲨烯为植物甾醇和三萜皂苷的共同合成前体（图7）。近年来，针对SS基因的功能研究发现主要有：邢朝斌等［16］通过分析刺五加不同器官、不同生长发育阶段及茉莉酸甲酯处理对SS家族的两个基因SS1和SS2表达水平及总皂苷含量的影响，揭示了SS1基因的表达水平高低与总皂苷含量呈显著正相关。孙颖等［10］将三七SS基因超表达载体导入三七细胞内，发现所有转基因细胞中的总皂苷含量及Rh1、Rh2、Rg1、Rb1、F1、Re等单体皂苷含量均显著增加。

图7 三七总皂苷生物合成途径Fig. 7 Biosynthetic pathway of PNS in P. notoginseng

此外，本课题组在前期的研究中发现，三萜皂苷合成途径中双基因甚至更多基因之间可能存在正协同调控效应［8，17］，因此，为了探清FPS、SS这两个关键酶对皂苷合成的联合调控效果如何，本研究构建了pCAMBIA1300S-FPS载体，并通过EHA105菌株转化已转SS的三七细胞，经双抗生素（Kan和Hyb B）筛选、基因组PCR鉴定，初步获得7株同时转FPS和SS的细胞系，其中3株因生长速度过慢，难以满足后续实验要求，将其舍弃，留下4株转双基因细胞系进一步进行qRT-PCR鉴定。在进行qRT-PCR分析时，不同细胞系之间可能存在RNA质量、产量和逆转录效率等方面的差异，由此可能会导致不同细胞系之间的目标基因表达差异难以被获得，因此，需一个内参基因对其进行校正。研究显示，利用三七GAPDH基因作为qRT-PCR分析的内参基因时，可获得特异性较高、稳定性较好的实验效果［18］。因此本研究将GAPDH为内参基因进行qRT-PCR分析。

4株转双基因细胞中FPS相对表达量均较对照更高，表明4株细胞均实现了FPS超表达。然而，4株细胞中FPS的相对表达量存在一定差异，分析导致差异存在的原因可能是外源FPS在不同细胞基因组中插入的位点不同而导致的；此外，细胞的生长状态也可能是致使差异存在的一个原因。4株转双基因细胞中SS的相对表达量较仅转SS细胞而言，无显著差别，表明4株转双基因细胞中pCAMBIA2300S-SS载体和pCAMBIA1300S-FPS载体的超表达互不干扰，此为未来进一步利用组合生物合成技术构建三七皂苷同源或者异源合成体系的重要前提。

总皂苷量测定结果显示，4株转双基因细胞中的总皂苷量较对照均有不同幅度增加，结合qRTPCR分析结果可知：在三七细胞中共超表达FPS和SS确实可有效提高FPS和SS的转录水平，从而打破由FPS和SS两个限速酶催化的限速反应束缚，促使皂苷合成代谢流得到强化，且共超表达双基因可进一步提升皂苷含量。

Re、Rb1、Rh1、Rd和Rg1是三七中药用价值较高的单体皂苷，研究证明Rh1在抗神经衰退及抗肿瘤方面发挥重要作用［19］；Rg1及Rd对心血管及中枢神经系统具有特殊保护作用［20-21］；Re可有效降低血液中葡萄糖和胆固醇浓度［22］；Rb1对治疗脑水肿、动脉血管痉挛效果显著［23］。对三七细胞中的这5种重要单体皂苷含量进行分析，结果显示4株转双基因细胞中均可检测到上述5种单体皂苷，对比未转基因对照，仅T-3中的Rb1含量出现下降趋势，推测可能的原因是pCAMBIA1300S-FPS载体随机插到T-3基因组上的位点影响到了合成Rb1相关酶基因的表达；其余细胞中的上述5种单体皂苷量均呈现出不同程度的增幅，其中以Re的增幅最为显著，推测可能的原因是：外源FPS片段在转基因细胞基因组中的插入位点对Re合成酶编码基因的表达具有一定激活作用，后续需进一步对该推测进行实验验证。

张萍等［24］研究证明3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是三萜皂苷合成途径中的关键酶之一，进一步在三七细胞中共超表达三七HMGR基因和SS基因，结果显示，转双基因细胞系中的总皂苷含量是仅转SS细胞的1.5倍，是未转基因对照的2.0倍，再次证实双基因之间存在正协同调控效应。然而，对比共超表达FPS、SS引起的总皂苷含量增幅，在三七细胞中共超表达HMGR和SS引起的增幅要更低些，推测可能的原因是：与HMGR相比，FPS位于皂苷合成途径中靠中游的位置，由其催化合成的反应中间物可为皂苷合成提供更为直接的前体；HMGR则位于较上游的位置，中间的合成步骤较多也较复杂，从而导致皂苷含量增幅稍小。此外，与共超表达SS、DS引起的总皂苷含量增幅相比，共超表达FPS SS引起的增幅与之相差较小，推测可能的原因是：FPS催化中游合成途径的第一个限速反应，DS则是进入达玛院型皂苷合成的分支，两者在三萜皂苷合成途径中均发挥较重要的作用，下一步可尝试3个或更多关键酶基因共超表达，以期获得更高皂苷表达水平的转基因三七细胞。

4 结论

在三七细胞中共超表达FPS、SS，可有效提高细胞中的总皂苷和部分单体皂苷量；此外，与仅超表达SS比较，共超表达FPS、SS能够进一步提高皂苷含量。