拟南芥F-box蛋白FKF1与转录因子FUL互作调控开花研究

周娟 阎晋东 李新梅 刘雪晴 赵强 赵小英

（湖南大学生物学院 植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室 湖南省杂交油菜工程技术研究中心，长沙 410082）

开花是高等植物生长发育进程中一个非常关键的阶段，受各种内源和外源因素影响［1］。拟南芥中主要有6种开花途径：光周期、春化、温度、赤霉素、年龄和自主途径［2-4］。这些信号途径既彼此独立又相互交联，形成一个复杂的调控网络，最终将开花信号汇聚到几个关键的开花整合因子如FLOWERING LOCUS T（FT），TWIN SISTER OF FT（TSF） 和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）等，从而激活花分生组织决定基因的表达如 LEAFY（LFY），FRUITFULL（FUL），CAULIFLOWER（CAL）和 APETALA1（AP1）等［5-10］，进而启动植物成花。

在拟南芥中，CONSTANS（CO）对FT基因表达的调控对于光周期开花至关重要［11-13］。F-box蛋白FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1（FKF1）作为蓝光受体参与植物体内光信号传导［14-15］。FKF1在下午时段通过26S蛋白酶体途径降解CYCLING DOF FACTOR 1（CDF1）蛋白，解除CDF1对CO转录的抑制作用，从而诱导FT表达促进开花［16-17］。FKF1蛋白还能直接与CO结合稳定CO蛋白［18］。此外，FKF1以光依赖的方式与CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）相互作用并抑制其同源二聚化从而抑制其活性，解除COP1对CO蛋白的降解以促进开花［19-20］。最近的研究表明，FKF1还能与赤霉素信号途径关键负调节子DELLA蛋白互作，通过促进DELLA蛋白降解进而促进植物开花［21］。

拟南芥MADS-box基因FRUITFULL（FUL）在控制拟南芥开花时间、花分生组织分化、茎生叶形态以及心皮和果实的发育中起到重要作用［22-26］。在茎尖，FT与bZIP转录因子FD形成复合物，以激活FUL的转录，从而促进成花转变和启动花发育过程［22，27-29］。在叶片中，FUL也可以通过促进FT基因转录加速开花［22］。FUL能够响应年龄途径，受miR156调控的转录因子SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 3（SPL3） 和 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 9（SPL9） 直接激活FUL基因的转录以诱导开花［22，30］。FUL也能够响应赤霉素信号途径，WRKY DNA-BINDING PROTEIN 12（WRKY12） 和 WRKY DNA-BINDING PROTEIN 13（WRKY13）分别是开花正调控和负调控因子，GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE（GAI）可以与WRKY12和WRKY13相互作用干扰它们对FUL基因转录的调节，从而调控开花［31］。REPRESSOR OF ga1-3（RGA）与SPL15相互作用抑制SPL15对FUL基因转录的激活，从而调控开花［32］。

本研究采用酵母双杂交筛选与FKF1互作的靶蛋白，鉴定到FKF1与FUL互作，并对FKF1与FUL的相互作用及两者在开花调控中的遗传关系进行了探究,旨为提高对FKF1和FUL控制植物开花时间机制的理解。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的拟南芥为哥伦比亚生态型（Col）。fkf1-t（S1ALK_059480） 和 fkf1-1突 变 体， 以 及35S-FKF1-Myc过表达转基因株系在我们以前的研究中已经报道［21］。ful-8（SAIL_726_E08）突变体购自拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。将 35S-FKF1-Myc与 ful-8进行杂交，获得35S-FKF1-Myc / ful-8双突变体。植物表达载体pCambia1300-Myc和pCambia1300-Flag，大肠杆菌DH5α，农杆菌AGL0为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 酵母双杂交分析 将FKF1克隆到pGBKT7载体中获得Bait质粒，其他候选基因克隆到pGADT7载体中获得Prey质粒。将Bait和Prey质粒共转入AH109酵母，涂布于二缺（-TL）平板上，28℃培养3 d左右。将5-10个单菌落重悬入100 μL的无菌水中，吸取4 μL左右重悬菌液分别点到二缺（-TL）和三缺（-TLH）平板上，28℃培养3-5 d，观察记录并拍照。

1.2.2 双分子荧光互补（BiFC）分析 将FKF1和FUL分别克隆到BiFC载体pSAT1-nVenus-N和pSAT1-cCFP-N中。参考Yoo等［33］的方法，将重组质粒共转化拟南芥原生质体，利用激光共聚焦显微镜观察荧光，并拍照。

1.2.3 免疫共沉淀（Co-IP）分析 将FKF1克隆到pCambia1300-Myc载体，FUL克隆到pCambia1300-Flag载体，获得35S-FKF1-Myc和35S-FUL-Flag重组质粒。参考Sparkes等［34］的方法，将两个重组质粒共转化烟草叶片，黑暗培养 24 h 后，光下培养2 d，收集叶片，用Co-IP buffer（150 mmol/L NaCl；50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；5 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.5% Titon X-100；3 mmol/L DTT；1 mmol/L PMSF；1×Coctail）提取总蛋白。留10%作为 input，剩余部分加入抗Myc磁珠孵育过夜进行免疫沉淀，磁珠用 washing buffer（150 mmol/L NaCl；50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；5 mmol/L EDTA，pH 8.0；3 mmol/L DTT）洗脱3次，然后在Input和洗脱后的磁珠中加入适量 loading buffer（0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.12 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8；5% 甘油 ；4% SDS；10%β-巯基乙醇；0.02%溴酚蓝），95℃煮 10 min 左右。12 000 r/min 离心 5 min 左右，将上清液取出，进行SDS-PAGE电泳，用Anti-Myc和Anti-Flag抗体进行Western blot分析。

1.2.4 蛋白稳定性分析 参照Yan等［21］的方法进行蛋白质稳定性分析。

（1）半体内蛋白稳定性实验：将原核表达纯化得到的GST-FUL蛋白与野生型Col，fkf1-1或者fkf1-t幼苗的总蛋白等比例混合，在22℃条件下孵育不同时间，取样进行SDS-PAGE电泳，用Anti-GST抗体进行Western blot分析。丽春红染色作为内标。

（2）体内蛋白稳定性实验：将携带35S-FKF1-Myc或者35S-FUL-Flag载体的农杆菌AGL0按不同比例共转化烟草叶片。黑暗培养24 h 后，光下培养2 d，收集烟草叶片。用液氮将叶片研磨成粉末后加入适当的loading buffer，95℃煮 10 min 左右，12 000 r/min 离心 5 min 左右，将上清液取出，进行SDS-PAGE电泳，用Anti-Myc和Anti-Flag抗体进行Western blot分析。丽春红染色作为内标。

1.2.5 mRNA水平分析 采用TRIzol 试剂（RNAiso Plus，TaKaRa） 提 取 总 RNA。 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan）试剂盒，根据说明书将RNA逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR，采用SYBR premix Ex Taq试剂盒，在CFX96 Real-time PCR System（Biorad）PCR仪器中进行。内参基因为 ACTIN2。利用 2-ΔΔct法对基因的表达量进行分析。

1.2.6 拟南芥开花时间统计 以拟南芥抽薹后，薹达到2 cm时开始统计两个开花指标：植株开花时莲座叶的数目以及从发芽到开花的生长时间。土里直播培养的拟南芥从种子发芽后开始计算开花时间，从培养基移栽到土里的植株从拟南芥幼苗移栽时间开始计算开花时间。每次统计的植株不少于10棵。

2 结果

2.1 FKF1的互作蛋白鉴定

FKF1蛋白在光周期开花途径中起着重要作用，但FKF1调节开花的分子机制尚不完全清楚。为了深入研究FKF1调控开花的分子机制，我们通过AraPPINet网站（http://netbio.sjtu.edu.cn/），选择了几个可能与FKF1存在相互作用，并且参与拟南芥开花的候选蛋白如FUL，SOC1和PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 3（PIF3）（表 1）。SOC1 已被认为是促进拟南芥开花的开花整合因子［35］。PIF3属于bHLH转录因子家族，是开花抑制因子［36］。FUL是花分生组织决定基因，在控制拟南芥开花时间、花分生组织分化、茎生叶形态以及心皮和果实的发育中起到重要作用。随后，我们采用酵母双杂交实验检测FKF1与这3个蛋白的相互作用。结果显示，FKF1与FUL和阳性对照GIGANTEA（GI）存在相互作用，与SOC1和PIF3无相互作用（图1）。

图1 酵母双杂交实验显示FKF1与FUL和GI相互作用Fig.1 Yeast two-hybrid assay showing the interactions of FKF1 with FUL and GI

表1 FKF1候选互作蛋白Table 1 Candidate interaction proteins of FKF1

2.2 FKF1与FUL蛋白的相互作用分析

为了进一步确认FKF1与FUL在植物体内是否相互作用，我们采用双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（CoIP）实验分析了两者的相互作用。在BiFC实验中，将FKF1-nVenus与FUL-cCFP一起转入到拟南芥原生质体中，通过激光共聚焦观察，在细胞核中检测到了GFP信号（图2-A），而阴性对照中则没有检测到荧光。与BiFC结果一致，在免疫共沉淀实验中FKF1与FUL相互作用。当使用抗Myc磁珠对FKF1-Myc进行免疫沉淀时，FUL-Flag被共沉淀（图2-B）。这些结果表明，FKF1与FUL在植物细胞核内相互作用。

图2 双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验分析FKF1与FUL的相互作用Fig.2 BiFC and Co-IP assays showing FKF1 interaction with FUL

2.3 FKF1对FUL蛋白稳定性和转录水平的影响

FKF1是F-box蛋白参与形成SCF泛素连接酶，介导靶蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。因此，我们检测了FKF1对FUL蛋白稳定性的影响。首先在大肠杆菌中表达GST-FUL重组蛋白，采用无细胞系统检测了FUL蛋白稳定性。在该实验中，将从大肠杆菌中纯化的GST-FUL蛋白分别与野生型植物，fkf1-1或fkf1-t突变体的总蛋白提取物混合孵育。如图3所示，GST-FUL蛋白在野生型植物和fkf1-1或fkf1-t突变体的蛋白提取物中均降解（图3-A），且降解速率基本一致（图3-B）。其次，我们将FUL-Flag与不同浓度FKF1-Myc在烟草叶片中共表达，检测FUL蛋白的稳定性，结果显示，存在FKF1-Myc或者不存在FKF1-Myc时，FUL-Flag蛋白稳定性没有明显变化（图3-C）。这些结果表明，FKF1不影响FUL蛋白的稳定性。

图3 FKF1对FUL蛋白稳定性的影响Fig.3 Effect of FKF1 on FUL protein stability

随后，我们检测了 FKF1和FUL是否相互调节各自的 mRNA水平。将野生型Col，fkf1-1，ful-8播种于1/2 MS固体培养基上，在长日照条件下培养不同天数，收集幼苗地上部分，用于mRNA表达分析。qRT-PCR结果显示，FUL在花芽分化期时期开始增加，在第11-15天之间，fkf1-1突变体中FUL mRNA水平显著低于野生型（图4-A）。然而，FKF1 mRNA水平在Col和ful-8突变体中没有显著性差异（图4-B）。这说明FKF1正调节FUL的转录水平，然而FUL对FKF1的转录水平无显著影响。

图4 FUL mRNA的表达受FKF1调节Fig.4 FUL mRNA expression regulated by FKF1

2.4 FUL突变对FKF1过表达植物开花表型的影响

为了进一步研究FKF1与FUL在开花调控中的遗传学关系，我们将FKF1过表达转基因植物35S-FKF1-Myc与ful-8突变体杂交得到35S-FKF1-Myc / ful-8植株，观察统计了双突变体在长日照条件下的开花时间。结果显示，与野生型相比，35S-FKF1-Myc植物表现出提早开花的表型，ful-8突变体表现出开花延迟的表型（图5-A-C），这与我们以前的报道以及前人的研究结果一致［21，37］。长日照条件下，FUL突变可以抑制35S-FKF1-Myc植物的早开花表型，并且35S-FKF1-Myc/ful-8双突变体与ful-8突变体表型相似（图5-A-C），表明FUL在调节开花过程中作用于FKF1的下游。

我们检测了ful-8突变体、35S-FKF1-Myc过表达、以及35S-FKF1-Myc / ful-8双突变体幼苗中FT的表达。结果显示，与野生型Col相比，FT的mRNA水平在ful-8突变体中显著降低，在35S-FKF1-Myc过表达植物中则显著增加（图5-D），这与突变体和过表达植物的开花表型相一致。同时，发现35S-FKF1-Myc / ful-8植物中FT的mRNA水平比35S-FKF1-Myc中的要低，与ful-8突变体中的相似（图5-D）。这些数据表明，FKF1与FUL在同一条通路上，通过促进FT的转录进而促进开花。

图5 Col，35S-FKF1-Myc，ful-8和35S-FKF1-Myc/ful-8植物开花表型Fig.5 Flowering phenotype of Col，35S-FKF1-Myc，ful-8 and 35S-FKF1-Myc / ful-8 plants

3 讨论

在合适的时间开花对大多数植物的生存和成功繁衍极为重要，植物已经进化出复杂而精细的调节机制，通过内源和外源信号来协调控制开花，使其在最佳时间开花。

MADS-box基因在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。迄今为止，已经在植物中发现数以百计的 MADS-box 基因。其中FUL是花分生组织决定基因，在控制拟南芥开花时间、花分生组织分化，心皮发育和果实发育中起主要作用［22-26］。与前人的报道一致［22，24，37］，ful突变体的开花时间比野生型植物晚，表明FUL正调节植物开花时间。作为开花整合因子，FT的转录受许多转录因子调控，其中一些转录因子起抑制作用如SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）、SCH-LAFMÜTZE（SMZ）、FLOWERING LOCUS C（FLC）和 TEMPRANILLO 1（TEM1）等［38-41］，而另一些则起激活作用如CO、CRYPTOCHROME-INTERACTI-NG BASIC-HELIX-LOOP-HELIX 1（CIB1） 和 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）等［12，42-43］。已有的研究表明，FT在光周期途径中作用于FKF1的下游［16-17］，同时也有研究表明FUL在叶片中能通过促进FT转录加速开花［22］。在本研究中，我们发现在ful突变体中FT转录水平降低，这与开花表型一致，表明 FUL正调节FT的转录。已知MADS结构域蛋白可与称为CArG-box的DNA基序结合，该基序具有共有序列 CC（A / T）6GG。CC（A / T）7G 和 C（A / T）8G也被认为对MADS结构域蛋白的结合很重要［44］。FT启动子中存在几种假定的CArG-box元件，这暗示FUL可能直接结合FT的启动子，促进其表达和植物开花，这还需要进一步通过生化实验进行验证。

FKF1对于拟南芥的光周期开花非常重要［14-15，21，45］。在长日照条件下，FKF1 过表达植物比野生型植物更早开花，而fkf1突变体开花比野生型植物更晚［21］。35S-FKF1-Myc / ful-8植物的开花表型与ful-8植物相似。这些结果表明FKF1与FUL在同一条通路上调节开花。并且FT在35S-FKF1-Myc /ful-8中的表达量与ful-8突变体一致，说明FKF1和FUL共同作用于FT。基于FKF1和FUL相互作用，FKF1不调节FUL蛋白的稳定性，我们提出FKF1可能通过与FUL相互作用激活FUL蛋白的转录活性，从而促进FT的转录，这有待于进一步研究。

此外，我们发现FKF1调节FUL的转录水平。由于FKF1本身不是转录因子，因此我们推测FKF1有可能通过与其他转录因子相互作用间接促进FUL表达，这尚待进一步研究。

4 结论

通过酵母双杂交，双分子荧光互补和免疫共沉淀实验验证了光周期开花调控因子FKF1与转录因子FUL存在相互作用；基因表达分析发现FKF1能够正调控FUL的转录水平，但并不影响FUL蛋白的稳定性；遗传学分析发现，FKF1与FUL能够共同调控下游开花基因 FT的转录，进而调控植物的开花时间。根据这些研究结果，我们提出FKF1与FUL在同一条信号通路上调控FT的表达和开花。