茶树CsCML24的克隆及表达分析

康芮 刘春晖 陈思文 赵仁亮 周琼琼

（河南农业大学园艺学院，郑州 450000）

茶 树（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze） 起 源于我国西南地区，喜温喜湿，主要分布在热带和亚热带地区，是我国重要的经济作物之一，在助力脱贫攻坚和乡村振兴战略中发挥着重要作用。近年来，由于全球气候不稳定性的增加，茶树在其生长周期内经常遭遇低温、干旱等逆境的危害，造成茶叶品质与产量严重下降，严重时甚至会导致茶树死亡，给茶产业的发展造成了极大的经济损失［1-2］，因此，如何提高茶树的抗逆性以抵御逆境伤害是育种工作者所关注的重点问题。

植物体内钙离子（Ca2+）作为细胞内重要的第二信使，广泛参与到植物的生长发育和外界刺激引起的信号转导途径。当植物受到刺激（包括激素处理、生物和非生物胁迫等）时，会引起细胞内外Ca2+浓度的瞬时变化，从而产生钙信号并通过钙靶蛋白进行信号转导，将信息传递到下游响应蛋白，进而调节体内相应的生理生化反应过程，最终使植物响应外界胁迫［3-4］。其中，钙靶蛋白对钙信号瞬时变化的感知和解码是钙信号传递途径中最关键的调控步骤。植物细胞内主要存在3种类型的钙靶蛋白：钙调蛋白/类钙调蛋白（calmodulins/CaMs，CaM-like proteins/CMLs）、钙调磷酸酶B类似蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）和钙依赖蛋白激酶（calciumdependent protein kinases，CDPKs/CPKs）［5-7］，这三大类钙靶蛋白介导的钙信号系统在植物应对生长发育、生物及非生物逆境中起着重要作用。

CMLs是植物特有的一类钙靶蛋白，含有1-6个钙离子结合的EF-hand结构域，是植物特有的一类钙靶蛋白。CMLs的功能仅有少数植物被研究，大部分家族成员的分子调控和生物功能仍未知，但它们在植物的生长发育、病虫害防御及外界条件刺激下发挥着重要作用［8-10］。据报道，拟南芥、水稻和番茄基因组中分别鉴别到50个［11］、32个［12］和52个［13］CML 基因，苜蓿中有 50 个 MtCMLs［14］。其中，拟南芥 AtCML8、AtCML24、AtCML37、AtCML38和AtCML39在非生物胁迫和ABA等刺激下表达量均显著提高［15-17］；AtCML42 在抵御昆虫时起重要作用［18］。水 稻 体 内 的 CML 基 因 OsMSR2（OsCML24）［19］、OsCML4［20］、OsDSR-1［21］和 OsCML16［22］受非生物胁迫（如低温、干旱和盐等）诱导。除了拟南芥和水稻，野 生 番 茄 ShCML44［23］、 杜 仲 EuCML5［24］、 苹 果MdCML3［25］、葡萄 VaCML21［26］等均在非生物胁迫下诱导表达。杜昱林［27］以茶树花粉为材料低温处理筛选到CsCML21。茶树逆境生理与分子生物学课题组前期以龙井长叶为材料克隆了5个茶树CML基因，分析了其组织表达特异性，并进行了低温、干旱、盐胁迫和ABA处理，结果显示，CML基因均有不同程度的诱导表达［28］。由此看来，CMLs的转录活性受到外界刺激的影响。

CML蛋白在植物抵抗低温、干旱、高盐和激素处理等外界刺激过程中发挥重要作用，是抗性分子育种的重要信号蛋白。然而，目前CML24的报道较少，其功能及其胁迫响应机制尚不清晰。

本研究以龙井43茶树品种为材料，克隆获得CsCML24，并对该基因编码的氨基酸序列进行序列比对、理化性质和进化树分析等。通过实时荧光定量PCR技术研究该基因在低温、干旱、盐胁迫和ABA处理下的响应模式，为进一步研究茶树CsCML24对逆境胁迫的响应机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以龙井43一年生扦插苗作为试验材料，选取长势一致的扦插苗置于光周期16 h/8 h、光照强度为240 μmol/（m2·s）、昼夜温度设置为 25℃/22℃、相对湿度为75%-80%的人工气候培养箱中进行预培养，一周后进行不同组织部位取样和逆境胁迫处理。

组织特异性分析：选取茶树植株的不同组织（包括根、茎、嫩叶、成熟叶和花），立即用液氮速冻并置于-80℃冰箱保存备用；逆境胁迫处理：以未处理的植株作为对照（CK），进行低温（10℃）、干旱（20%PEG 6000）、高盐（200 mmol/L NaCl）和ABA（100 μmol/L）处理，分别在胁迫处理后0、2、4、8、12和24 h取样（取第3片叶），每个时间设3个生物学重复，液氮速冻，-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 茶树总RNA提取及cDNA合成 利用RNA-prep Pure Plant Kit植物多糖多酚试剂盒（天根生化科技有限公司）提取茶树总RNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，合格的RNA样品于-80℃保存。以检测合格的RNA为模板，使用 HiScript® III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）完成基因组DNA的去除和cDNA第一链的合成。

1.2.2 茶树CsCML24的克隆 使用Primer Premier 5.0软件设计CsCML24的CDS区全长引物，序列为CsCML24-F和CsCML24-R（表1）。以获得的cDNA为模板，使用高保真酶Primer STAR® HS DNA Polymers进行PCR扩增。PCR体系为50 μL。PCR反应程序为 98℃ 3 min ；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃30 s，30个循环；72℃ 7 min。使用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，将目的条带切胶回收、纯化。将纯化的产物与pClone007 Simple Vector克隆载体连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司进行测序验证。

1.2.3 茶树CsCML24的生物信息学分析 利用NCBI网站（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov /Blast.cgi）进行BLAST和蛋白保守域的预测。利用在线工具包ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）对CsCML24编码的蛋白进行理化性质分析。利用在 线 软 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白质磷酸化位点、信号肽和跨膜结构域。在PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）网站上预测蛋白质亚细胞定位。利用Prabi-gerland（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）和Swiss-model软件来预测分析蛋白质的二级结构和三级结构。使用DNAMAN9.0软件进行CsCML24氨基酸多序列比对。利用MEGA7.0软件MEGE-X邻近归并法（neighbor-joining method）构建茶树CsCML24与其他物种的系统进化树。

1.2.4 茶树CsCML24的表达特性分析 使用Premier 5.0软件在CsCML24的CDS区内设计定量引物，定量引物序列为CsCML24qRT-F和CsCML24qRT-R（表1）。将反转录的cDNA稀释到200 ng/μL后作为模板，以CsPTB作为内参基因（GenBank登录号为GAAC01052498.1），进行荧光定量分析。参照Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书（诺唯赞，南京）进行操作，利用Applied Biosystems 7500FAST荧光定量仪进行qRT-PCR反应，分析CsCML24在茶树不同组织中的表达模式，以及受到低温、ABA、高盐和干旱非生物胁迫后的相对表达量变化。采用2-△△CT法进行定量数据分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果

2.1 茶树CsCML24的克隆及序列分析

以龙井43cDNA为模板，利用特异性引物CsCML24-F和CsCML24-R进行PCR扩增和测序，克隆得到CsCML24（GenBank登录号为MZ325391）。经测序，该基因CDS长度为480 bp，预测可编码159个氨基酸（图1）。

图1 CsCML24的克隆Fig. 1 Cloning of CsCML24 gene

2.2 CsCML24编码蛋白理化性质分析

应用在线软件对该蛋白质进行理化性质分析，预测该蛋白质的分子式为C1386H2294N480O593S96，原子总数为4 849，分子量为38 248.08 Da，理论等电点为5.23，由159个氨基酸组成，不稳定系数为38.05，脂肪系数为22.08（表2）。用DNAMAN9.0软件对蛋白进行亲/疏水性分析，结果（图2）显示，该蛋白疏水性最高的位点在第155位氨基酸为1.456，亲水性最高的位点在第85位氨基酸为-1.889，总平均值为负值（Gravy）-0.596，属于稳定的亲水性蛋白。CsCML24为非跨膜蛋白，SignalP-HMM在线预测CsCML24不具有信号肽，属于非分泌蛋白。亚细胞定位预测显示，该蛋白可能位于细胞质中。

表2 CsCML24蛋白的基本理化性质Table 2 Basic physicochemical properties of CsCML24 protein

图2 茶树CsCML24氨基酸序列亲疏水性分析Fig. 2 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of amino acids in CsCML24 from C. sinensis

2.3 保守基序预测及蛋白结构分析

CsCML24蛋白的二级结构主要由α-螺旋构成，占49.06%，除此之外，还含有9.43%的β-转角和6.92%的延伸片段，以及34.59%的无规则卷曲（图3）。对CsCML24三级结构预测结果显示，其三维结构推测与二级结构基本吻合，其中，α-螺旋占蛋白质结构的大部分区域，无规则卷曲和β-折叠分散其中（图4）。对CsCML24进行磷酸化结构预测，结果表明，丝氨酸的磷酸化位点可能有12个，位于多肽 链 的 第 12、14、16、34、36、40、46、61、65、78、138和149位氨基酸，其中，14、34、46、61、65位氨基酸的预测值均在0.934以上，说明这些位点的氨基酸发生磷酸化的可能性很高。丝氨酸可能的磷酸化位点有8个，苏氨酸可能的磷酸化位点有4个（图5）。

图3 茶树CsCML24二级结构预测Fig. 3 Secondary structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

图4 茶树CsCML24三维结构预测Fig. 4 3-dimension structure prediction of CsCML24 in C.sinensis

图5 茶树CsCML24磷酸化位点预测Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsCML24 in C.sinensis

2.4 CsCML24进化树分析和氨基酸序列比对

将CsCML24的氨基酸序列在NCBI上进行同源性搜索和保守域预测，结果显示该氨基酸属于Ca2+结合蛋白，含有Ca2+结合位点，属于EF-hand超家族，在16-80氨基酸位点中间含有EF-hand特异结构域（图6）。多重序列比对结果显示茶树CsCML24与 猕 猴 桃（Actinidia rufa）、 陆 地 棉（Gossypium arboreum）、樱桃（Prunus avium）等多个物种的CML具有较高相似性，相似性均在70%以上，且这些物种中的CML蛋白中均含有EF-hand结构域和Ca2+结合位点（图7）。通过构建进化树分析发现茶树CsCML24与猕猴桃、烟草等亲缘关系较近，与桃、李子、樱桃等蔷薇科的植物亲缘关系较远，该系统进化树反映了CsCML24蛋白的进化规律（图8）。

图6 茶树CsCML24保守结构域预测Fig. 6 Conserved domain prediction of CsCML24 in C. sinensis

图7 CsCML24氨基酸序列与其他植物的多重序列比对Fig. 7 Multiple sequence alignment of amino acid sequences among CsCML24 and other plants

图8 CsCML24与其他物种氨基酸序列的系统进化树Fig. 8 Phylogenetic tree analysis of deduced amino acid sequences of CML24 from C. sinensis and other plant species

2.5 CsCML24组织表达模式分析

通过实时荧光定量PCR技术，分析CsCML24在茶树的根、茎、嫩叶、成熟叶和花中的表达水平。结果显示，CsCML24在成熟叶片中表达量最高，在根和花中的表达量次之，而在茎中表达量相对较低，说明CsCML24随着茶树的生长发育，在叶片中的表达量呈逐渐升高的趋势（图9）。由此推测CsCML24在叶片的发育中起到重要作用，在茶树的根和花中也有着一定的作用。

图9 CsCML24在茶树不同组织部位中的表达模式Fig. 9 Expression patterns of CsCML24 in various tissues of C. sinensis plant

2.6 CsCML24对非生物胁迫的响应

茶树CsCML24在4种胁迫下均能诱导表达，不同胁迫及不同处理时间下该基因的表达存在差异。在低温处理下，CsCML24的相对表达量呈先升高后降低随后又升高的趋势，在处理4 h时其表达量达到最大值，为CK的5.68倍，在处理的8 h和12 h时，表达量也很高，分别为CK的5.37和3.76倍，24 h时表达量低于对照水平。在外源喷施ABA处理下，CsCML24表达量在2 h内明显增加，与对照组差异显著，随后下降，在4 h降至最低，随后8、12和24 h后表达量与对照组相比显著上升，分别为CK的2.25、1.98和1.91倍，表明CsCML24的表达受到ABA信号的诱导。盐胁迫下CsCML24表达量在4 h时表达量显著低于对照组，在8 h时达到最大，为CK的1.37倍，之后逐渐下降。在干旱胁迫下CsCML24表达量呈现上升趋势，在2 h时出现显著增长，4 h表达量降至最低，之后表达量又开始上升，在24 h后与对照相比表达量呈上升趋势（图10）。

图10 CsCML24在不同胁迫条件下的表达情况Fig. 10 Expression analysis of CsCML24 gene under different stress treatments

3 讨论

Ca2+是植物介导各种激素和环境信号的重要信使，广泛参与到植物的生长发育以及逆境胁迫的调控之中。类钙调蛋白作为一类重要的钙感受器，在Ca2+信号通路中发挥重要作用。本研究从龙井43茶树中克隆了CsCML24，该基因cDNA全长为480 bp，编码159个氨基酸，该蛋白为亲水性的非跨膜蛋白，含有EF-hand保守结构域，序列分析显示与其他植物的CML具有较高的相似性，表明不同物种的CML蛋白之间存在着较近的进化关系。

CML具有组织特异性。张满仓等［29］发现马铃薯StCML主要在花、叶柄、芽和块茎等中有特异表达。李迎迎等［30］在‘西伯利亚’百合中发现LiCML在花药中表达量最高，而在根、茎、子房和花柱中的表达量极少。Ma等［28］在茶树中克隆出CsCML16、CsCML18-1、CsCML18-2、CsCML38和 CsCML42五个CML基因，这些基因在茶树的各个部位中也都有表达。本研究中CsCML24在茶树不同组织部位中的表达水平差异较大，在成熟叶片中表达量最大，其次是根，而在茎中的表达量最低，说明基因的转录水平在不同组织中存在差异。

研究表明植物CML基因的表达受非生物胁迫的诱导。如AtCML24能够在拟南芥中响应高温、低温、氧胁迫及ABA的诱导中表达，参与到拟南芥的非生物胁迫响应中［31］。OsCML16在低温胁迫下表达量显著提高，可能参与到水稻冷胁迫响应中［22］。在番茄中，过表达SlCML44的番茄植株对寒冷、干旱和盐胁迫表现出更强的耐受性，并且具有更高的发芽和更好的幼苗生长，SlCML16和SlCML51也在冷胁迫下被诱导，推测其可能也参与到番茄对冷胁迫的响应中［23］。申清湄［32］对苜蓿低温胁迫下MfCML24表达分析的研究结果显示，MfCML24在低温逆境表达量变化为“升-降-升”3个阶段。在本研究中，低温和干旱胁迫下CsCML24表达量均明显上调，与申清湄的研究结果相似，说明CsCML24的表达受低温和干旱胁迫的诱导，CsCML24可能参与植物响应低温、干旱胁迫的调控；在盐胁迫下，CsCML24的表达呈现先升高后降低的趋势，而且相较低温、干旱和ABA处理下，该基因的表达量整体比较低，说明该基因对盐胁迫不敏感，不同物种的CML基因表达模式可能存在差异；CsCML24在ABA诱导的表达量呈上升-下降-上升的状态，说明其在ABA依赖型调控途径中可能起到重要作用。其中CsCML24在非生物胁迫处理下，2 h的时候表达量明显增加，而在4 h表达量下降，之后又上升，这种变化可能与植物的应激反应有关［33-35］，猜测基因可能在植物应对非生物胁迫中存在两个调控途径，在刚遭遇非生物胁迫时，植物感应到各种外源信号的时候很敏感，引起植物的应激反应，从而引起相关基因的快速上调表达，之后植物开始缓慢适应逆境环境，启动另一种抗逆境胁迫途径，来让植株缓慢适应环境，尽可能减少环境对植株的损伤，这与刘伟等的［24］研究结果相一致，杜仲EuCML5的表达量在盐处理4 h时也是下降的。综上，本研究通过克隆龙井43茶树CsCML24并研究其在不同组织中的表达差异，及不同非生物胁迫处理下的表达模式，结果表明，CsCML24在多种胁迫下均有响应，可能参与到多种植物对胁迫的调控作用，这为今后研究该基因功能及其逆境胁迫下的作用机理提供理论基础。

4 结论

克隆获得一个类钙调蛋白基因CsCML24，其含有典型的EF-hand保守结构域，能与Ca2+结合发挥钙调蛋白的功能。CsCML24在茶树各组织中均表达，在成熟叶的表达量显著高于其他组织，茎中表达量较低。低温、干旱、高盐和ABA均能诱导CsCML24的表达，且在不同胁迫下表达差异显著，推测该基因可能在茶树响应和抵抗非生物胁迫的过程中发挥作用。