不同产区花椒油的椒麻感官特性及物质组成

高夏洁，钟 葵*，赵 镭，高海燕，史波林，汪厚银，王思思

（1.中国标准化研究院农业食品标准化研究所，北京 102200；2.上海大学生命科学学院，上海 200444）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是一种食药两用经济作物，其果实被誉为“八大调味品”之一，备受消费者喜爱[1]。花椒制取的花椒油有效解决了花椒食用不便的问题[2]，是目前最常见的花椒加工品。花椒油味道温和、椒香浓郁、醇麻爽口[3-4]，且炸花椒油的咸香风味更浓郁，还具有除腥去膻、增香调味的功效，深受消费者喜爱[1]。

研究表明，酰胺类物质是花椒中麻味的主要来源和品质评价的重要指标，花椒的麻感强弱、麻感持续时间及感觉属性描述均与酰胺类物质含量及种类组成具有一定相关性，酰胺种类和含量直接决定了花椒的辛麻程度[5]。不同产地来源的花椒，在麻味物质含量、麻感强度和特征上差异较大[6]。高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）联用法在物质含量的定量检测方面应用较为广泛，郭静等[7]研究指出HPLC法检测花椒麻味物质含量的技术指标：检出限为0.033 9 μg/mL，回收率范围为87.8%～112.8%，重复性实验中标准偏差的变动范围为0.20%～1.61%，该方法其准确度和精密度都较好。时间-强度（time intensity，TI）法[8-9]是评价员对食品感官分析中产品的感官属性随时间的推移而产生的变化，其中包括随时间推移给定感觉强度的变化记录，应用TI法可以用于评价食品（花椒）某一感官属性的最大感知强度、感受到最大感知强度的时间、持续的时长以及感知-时间动态变化。这种方法常用于葡萄酒的品评，并逐渐普及到很多食品感官评价领域，如辣椒[10]、巧克力[11]以及冰淇淋[12]等。关于花椒油的麻感及麻味物质目前研究较少，关于花椒的麻感研究主要集中在总含量[13]和麻感[14]初步测定等方面，关于花椒油的麻味物质主要集中在成分分析及抗氧化性、抑菌性研究，对于不同产地花椒油的麻味物质及麻感差别目前研究较少。

本实验通过感官评价及HPLC-MS对17种不同产区花椒制备的花椒油进行麻感强度和酰胺类物质测定，阐明我国不同产区花椒油的麻感风味特征，研究结果旨在为花椒油麻感风味数据库提供基础理论支持，为市售花椒油依据麻感特征产地溯源提供基础数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒样品均为红花椒，其中四川花椒样品由成都珪一食品开发股份有限公司提供，其余样品均由陕西省韩城市花椒管理局提供，详细信息见表1。

表1 花椒样品产地及品种信息Table 1 Geographical origin and cultivar of Sichuan pepper samples tested in this study

花椒油树脂 韩城市宏达花椒香料有限公司；羟基-α/β/γ-山椒素标准品（纯度≥98.0%） 成都麦德生科技有限公司；无水乙醇（分析纯） 河南荣腾食品添加剂有限公司；甲醇（色谱纯） Fisher实验器材（上海）有限公司；纯净水 深圳市景田食品饮料有限公司；色谱测试中所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利仪器（中国）有限公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；TSQ Quantum HPLC-MS联用仪 赛默飞世尔科技有限公司；ZORBAX 300 SB-C18色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 μm） 安捷伦科技有限公司；DC-320AS型电子天平 南京苏测计量仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒油制备处理

参考文献[15-18]方法，开展热炸花椒油预实验，考察不同油温（110～230 ℃）、油炸时间（5～30 min）下花椒油的风味品质研究，最终确定花椒油制备工艺如下：菜籽油→油浴加热→加入花椒→恒温油炸→冰水冷却→过筛（90 目）→花椒油。

上述工艺中，将菜籽油加入100 mL棕色锥形瓶中、添加量为25.00 g，油浴加热温度至180 ℃后恒温20 min，迅速加入5.00 g破碎花椒粒，加盖后油炸6 min，取出后迅速用冰水冷却，冷却至常温后（5～10 min）密封冷藏，放置第2天后上机测试及用于感官实验。

1.3.2 感官评价

1.3.2.1 培训小组组建

通过评价员的筛选与培训，麻感评价小组应满足GB/T 16291.1ü2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优选评价员》[19]优选评价员的基本要求，采用实验室前期研究建立的花椒麻度感官评价的15 cm标记线性标度[20-21]。首先，由经验丰富的感官分析师统一评价小组的感觉测量范围，建立3 点麻感标度及其标度值：3 cm-微麻、7.5 cm-较麻、10 cm-麻，并通过培训使评价员能够很好掌握麻度标度值对应语义。

通过GB/T 16291.1ü2012[19]评价员的基本要求进行筛选，并进行测试样品前培训。在15 cm标记线性标度上建立3 点麻感标度及其标度值如图1所示，参比样由花椒油树脂提取液稀释得到，将1 g花椒油树脂采用超声辅助提取，离心后上清液移至100 mL棕色容量瓶中，残渣重复洗涤2次，定容得到麻感提取液母液。稀释作为参比样，质量浓度分别为0.17、0.35、0.44 mg/mL，依此对应麻感标记线性标尺中的微麻、较麻及麻。通过标度值对应语义参比样的培训直至候选评价员能很好掌握不同参比样对应不同语义及麻感强度值为止。对候选评价员进行花椒油样品随机供样，将150 μL花椒油由移液枪送入评价人员舌头中前部位置，同时由感官分析师计时，实验在经过标准化设计的纸质回答表上进行，强度评价时间为入口开始计时，每隔30 s记录口腔感知的整体麻度，直至900 s实验结束。选用实验结果重复性好、一致性高（3次重复实验结果无显著性差异）的候选评价员作为麻感评价小组。

图1 15cm麻感标记线性标尺Fig.1 Fifteen-cm scale for of numb taste intensity

1.3.2.2 TI法评价

实验在经过标准化设计的纸质回答表上进行，由感官分析师进行统一计时，评价员在规定的时间点上参考15 cm麻感强度参比标度进行强度估计。评价人员在正式评价前先漱口，感官分析师将150 μL花椒油由移液枪送入评价人员舌头中前部位置，同时由感官分析师计时，在感官评价回答表上进行，强度记录评价时间为入口开始计时，90 s前每隔10 s记录口腔感知的整体麻度，90 s后每隔30 s记录一次，直至900 s实验结束。每个样品重复测定3次，样品呈送符合随机、平衡原则。在实验过程中允许小组成员在实验之间短暂休息，并在必要时离开感官实验室进行调整，避免味觉疲劳给实验结果造成不必要的误差。

1.3.3 酰胺类物质含量测定

1.3.3.1 样品预处理

参考方正等[18]的HPLC分析方法。准确称取5.00 g花椒油（精确到0.01 g），倒入250 mL棕色具塞锥形瓶中，加入75 mL无水乙醇，振荡摇匀。20 ℃超声提取20 min后将混合液倒入带盖离心管中，少量乙醇润洗锥形瓶并将洗液一并转入离心管中，2 000 r/min离心5 min，将上清液倒入200 mL棕色容量瓶中，在离心管中另加入25 mL分析级乙醇，旋涡振荡1 min，2 000 r/min离心5 min，将上清液倒出。离心管中再加入25 mL分析级乙醇，重复洗渣1次，合并3次上清液于棕色容量瓶中，定容摇匀后即为母液。稀释过膜：用移液器吸取0.5 mL母液于10 mL褐色容量瓶中，用甲醇定容，吸取1 mL过0.22 μm有机系滤膜转移至液相进样小瓶中，待上机测试（每个样品3个平行样）。

1.3.3.2 HPLC-MS分析条件

ZORBAX 300SB-C18色谱柱（4.6 mmh250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）；流速0.85 mL/min；检测波长270 nm；进样量10 μL；洗脱条件：0～15 min，40% A，60% B；15～40 min，50% A，50% B。

1.3.3.3 定性分析

利用高分辨质谱对花椒中各色谱峰进行定性分析，通过对样品总离子流图、提取离子流图及m/z50～600之间的离子二级碎片信息进行分析，样品中各色谱峰由电喷雾离子源正离子模式质谱图给出的[M+H]+离子及m/z，可确定离子为加氢离子，即得到化合物分子质量，通过高分辨质谱二级谱图信息、计算得出化合物组成、同位素分布等，结合文献进一步推断各酰胺类物质可能结构信息。

1.3.3.4 定量分析

对花椒油中含量较高的羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素3种物质分别采用相对应的标准品进行定量分析，其他酰胺类物质则采用羟基-β-山椒素为对照品，以期能更加准确地对酰胺类物质含量进行分析。选择羟基-β-山椒素是因为主要麻感物质羟基-α-山椒素极其不稳定，含量易随着时间、光照等因素有所变化[18]，且其含量显著高于花椒油中其他酰胺物质，以其为标样时误差较大。因此，采用含量与其他酰胺物质更为接近、性质更稳定的羟基-β-山椒素组为内标对其他酰胺类物质进行定量[18,20-22]。

羟基-α/β/γ-山椒素含量采用外标法计算，按式（1）计算：

式中：M为样品中羟基-α/β/γ-山椒素含量/（μg/g）；m为上机测试样品中羟基-α/β/γ-山椒素质量浓度（依据标准曲线计算得到）/（μg/mL）；20为母液稀释倍数；V为母液体积/mL；m’为样品质量/g。

其他酰胺类物质含量采用内标法，按式（2）计算：

式中：M’为样品中酰胺类物质含量/（μg/g）；m’’为添加内标物羟基-β-山椒素标准品的质量，2 000 μg；As为酰胺类物质峰面积；ΔA为加入内标和不加内标所测定的羟基-β-山椒素峰面积之差；m’为样品质量/g。

以色谱峰面积为纵坐标，标准品质量浓度为横坐标，得到的羟基-β-山椒素标品HPLC标准曲线为y=121.77x-20.558，相关系数R2=1，适用质量浓度范围为0.02～200 μg/mL；羟基-α-山椒素标准品HPLC标准曲线：y=80.112x-38.24，相关系数R2=0.999 9，适用质量浓度范围为0.02～200 μg/mL；羟基-γ-山椒素标准品HPLC标准曲线为y=39.073x-22.096，相关系数R2=0.999 9，适用质量浓度范围为0.02～200 μg/mL。

1.4 数据处理

采用Origin 2021作散点图及柱形图、IBM SPSS Statistics 23进行非线性曲线拟合、Metabo Analyst进行偏最小二乘判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）法数据统计分析及热图与树状图绘制。

2 结果与分析

2.1 不同产区花椒油麻感的TI评价

与酸甜苦咸鲜等基本味觉具有的感知速度快、持续时间较短并不相同的是，麻感具有感知速度慢、持续时间较久的特征，且随时间延长麻感强度呈现动态变化。由图2可知，17个花椒油样品均呈现出麻感强度快速上升然后缓慢下降的趋势特点。花椒油入口后麻感一直快速持续上升，约60～120 s时麻度达到最强值，随着时间进一步延长，麻度逐渐降低，麻感消失时间约在360～600 s之间，所有花椒油样品都呈现出麻感强度快速上升然后缓慢下降的趋势特点。这与徐珊珊[20]研究中关于花椒的TI曲线，以及方正等[18]研究关于花椒油树脂的TI曲线动态规律一致。

图2 花椒油样品麻感的时间-强度曲线图Fig.2 Time-intensity curves for numb taste of pepper oil samples

对样品的TI曲线进行5次非线性曲线拟合，计算样品的最大强度（Imax）、曲线下面积、最大强度出现的时间（Tmax）和总体持续时间（Ttot）4个参数，结果如表2所示。不同产区及品种的花椒油样品通过TI得到的麻感参数存在显著差异（P＜0.05），如四川汉源南椒花椒油（Z9）的Imax和Ttot值显著高于其他花椒油样品（P＜0.05）；甘肃临夏伏椒花椒油（Z5）具有较小的Imax和曲线下面积值；陕西韩城大红袍花椒油（Z12）具有较大的曲线下面积和Tmax值。因此，TI曲线的4个参数之间存在较高的相关性，且参数值之间的差异与花椒原料的产区及品种相关。

表2 花椒油与麻感强度的TI参数（n=5）Table 2 Parameters from time-intensity curves (n = 5)

甘肃花椒油样品及四川茂县、汶川花椒油样品的Tmax、Ttot和曲线下面积较其他花椒油样品偏低，属于“入口即麻、麻感消失快”一类。四川南椒Z9及Z10的Imax较高，Z11的Imax较低，推断这类花椒属于“麻感刺激型”，即麻感较“尖锐”。以大红袍为代表的陕西、山西、河北及山东莱芜未知品种花椒油，这类花椒油Tmax、Ttot较高，麻感类型为“后麻、麻感消失慢”型。伏椒果皮厚，单颗相比大红袍等品种普遍相对较重，因此在简单破碎后以高温油为溶剂提取出麻感物质比例小于大红袍等其他品种，这是甘肃伏椒制取的花椒油强度为中麻及低麻的原因之一，另外根据相对文献报道，样品麻度的TI曲线特性由样品中的酰胺类物质种类决定[23-24]，如羟基-α-山椒素的持续时间为300 s，羟基-β-山椒素的持续时间为200 s，α-山椒素的持续时间可达500 s以上[25]；合成的麻感酰胺花椒麻素麻感持续时间可达1 800 s[26]，由此可知，不同物质构成的差异使样品的TI曲线特性存在差异。

2.2 不同产区花椒油的麻感物质测定

表3 7种花椒中天然麻感酰胺类物质Table 3 Seven amide compounds responsible for numb taste from Chinese red pepper

为了进一步分析不同产区及品种花椒制取的花椒油中物质的构成[22]，使用HPLC-MS对花椒油进行麻感物质表征，参考前期团队研究结果[18,20]，鉴别花椒油中7种重要呈麻酰胺类物质（表3），分别为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素、β-山椒素及花椒油素[23]。

如图3所示，不同产区红花椒制取的花椒油总酰胺类物质含量介于2 710.26～9 541.44 μg/g之间，不同样品间存在显著差异（P＜0.05）。Z10（四川盐源南椒）炸花椒油总酰胺类物质含量最高，为（9 541.44f17.23）μg/g；Z5（甘肃临夏伏椒）炸花椒油总酰胺类物质含量最低，为（2 710.26f4.89） μg/g。Z1～Z15花椒油样品中，已知鉴定出的7种呈麻物质含量为1 757.61～9 323.78 μg/g，不同样品间存在显著差异（P＜0.05），Z1～Z15花椒油样品的7种主要麻感物质含量占总酰胺类物质含量的93.64%～97.23%，但是Z16及Z17与其他样品不一致，研究中7个主要麻感物质在Z16总酰胺类物质含量中占比仅为56.23%，在Z17中为81.82%。经过当地气候、地形等因素的循化，山东莱芜这2类花椒样品形成了自己独特的酰胺类物质特点，区别于其他产区花椒油样品。

图3 花椒油样品酰胺类物质总含量Fig.3 Total amide contents in pepper oil samples

为了减少分析中的干扰及误差[27-29]，将7种主要麻感物质进行单独分析作热图，热图将花椒中呈麻物质含量数据可视化[30-31]，结果如图4所示。甘肃伏椒、棉椒及四川茂县、汶川大红袍（Z1～Z8）的麻感物质含量较为均衡，其羟基-γ-山椒素及羟基-γ-异山椒素较大红袍及山东未知品种花椒油高，而四川南椒（Z9～Z11）的羟基-γ-山椒素及羟基-γ-异山椒素含量较其他花椒油样品更高。四川茂县、汶川花椒油大红袍品种花椒油（Z7～Z8）在麻感物质构成上与甘肃伏椒（Z1～Z5）相似度很高。大红袍品种（Z12～Z15）羟基-ε-山椒素及羟基-β-山椒素含量较其他花椒油样品更高，山东未知品种花椒油（Z16～Z17）不含羟基-γ-山椒素及羟基-γ-异山椒素，且花椒油素仅在Z16及Z17中含有，与其他花椒油样品形成鲜明差异，β-山椒素仅在Z1及Z17中含有且Z17中含量更高。

图4 花椒油样品主要麻感物质热图Fig.4 Heat map of main numb taste-active components of pepper oil samples

2.3 基于主要麻感物质含量分析不同花椒油麻感物质差异

采用PLS-DA对不同产区花椒油样品中关键呈麻物质含量进行分析，如图5所示，第1主成分对结果的解释占比66.4%，第2主成分对结果的解释占比17.9%。前2个特征值的累计贡献率已达84.3%，表明第1主成分及第2主成分可以基本包含样本的全部信息。这4类有麻感物质区别的花椒油样品在95%的置信区间空间分布区域性明显，模型参数Q2＞0.6，R2及Q2相差没有超过0.3，表明模型具有较好的预测能力。由图5可知，花椒油素及β-山椒素是山东莱芜大小颗粒未知品种花椒油品种特征物质，能有效地与其他品种花椒制取的花椒油区别开。羟基-ε-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-α-山椒素为陕西、山西及河北大红袍花椒油的特征物质；羟基-γ-山椒素为四川南椒的特征物质；羟基-γ-异山椒素为甘肃伏椒、棉椒及四川茂县、汶川大红袍特征物质。

图5 花椒油样品的主要麻感物质PLS-DA双线图Fig.5 PLS-DA score and loading plots of main numb taste-active components of pepper oil samples

通常研究认为变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值大于1时表示该物质对PLSDA模型建立有重要作用[19]。图6结果表明，羟基-γ-异山椒素、羟基-γ-山椒素、花椒油素对模型的影响度相对更高。

图6 花椒油样品主要麻感物质PLS-DA的VIP值Fig.6 PLS-DA VIP values of main numb taste-active components of pepper oil samples

2.4 基于酰胺类物质及TI曲线参数与产区关联分析

为进一步分析17种花椒油样本之间的麻感物质与TI曲线参数的相关性，利用SPSS 20.0及MetaboAnalyst的聚类分析法，将HPLC-MS检测出的7种主要麻感物质含量以及2.2.2节中麻感感官数据üüTI曲线参数联合进行聚类分析，数据通过MetaboAnalyst中的以平均值为中心并除以每个变量的标准差自动缩放处理方法进行归一化，结果如图7所示。17种花椒油的聚类结果为（欧氏距离平方为6时）：17个样品可分为4类，甘肃棉椒、伏椒及四川茂县、汶川大红袍制取的花椒油聚为1类；四川南椒聚为1类；陕西、山西、河北大红袍聚为1类；山东莱芜大、小颗粒未知品种花椒制取的花椒油聚为1类。由此可见麻感物质组成及含量与其原材料花椒的产区及品种有很大的相关性。

图7 花椒油样品的系统聚类分析Fig.7 Dendrogram obtained from cluster analysis of pepper oil samples

3 结 论

本实验选取17个不同产地红花椒制备热炸花椒油，采用TI法评价不同产地花椒油的椒麻强度的动态变化，通过TI参数Imax、Tmax、曲线下面积和Ttot揭示不同产地花椒油椒麻特征差异。进一步采用HPLC技术对这17个不同的花椒油样品中主要的麻感物质进行定量分析，并结合PLS-DA进行降维分析，阐明不同产地花椒油的关键呈麻物质组成及差异。结果表明，花椒油中椒麻感官特征及麻感物质组成与花椒油原料的产地及品种密切相关，聚类分析可将17个不同产地热炸花椒油分为4类，甘肃棉椒、伏椒及四川茂县、汶川大红袍制取的花椒油聚为1类；四川南椒聚为1类；陕西、山西、河北大红袍聚为1类；山东莱芜大、小颗粒未知品种花椒制取的花椒油聚为1类。由此可见麻感物质组成及含量与其原材料花椒的产区及品种有很大的相关性。研究结果为通过麻感物质鉴别产区及品种提供数据支持，为后期麻感物质以及麻感属性的相关性研究提供数据参考。