补肾启枢法治疗慢性心力衰竭理论探讨及分子机制研究*

韦祖猛 田 鑫 李 唐 王 兴 廖金花 彭双凤 凌 利 李 林

慢性心力衰竭由多种病因导致的以心室充盈或射血能力受损为特点的一组临床综合征。主要临床表现为心功能受损诱发的呼吸困难、乏力，以及肺循环、体循环淤血导致的组织水肿，其病情复杂，预后差，病死率高。在中医历代文献中，此病常因其症状特点而被归属于“心悸、怔忡、胸痹、心水、喘咳、 水肿”等病证的范畴，属本虚标实、虚实夹杂之证，其病位在心，五脏相关，以心之气阳亏虚为本，痰浊、瘀血、水饮为标。江西中医药大学刘中勇教授具多年辨治心力衰竭经验，认为其病在除心之外的四脏中，尤以脾肾与之最为密切，故提出补肾启枢治法，并在温阳利水名方真武汤的基础上自拟补肾启枢强心颗粒以辨治此病，临床疗效确切[1]。该方药物组成为炮附片、党参、淫羊藿、菟丝子、茯苓、白术、陈皮、桂枝、泽泻、猪苓、甘草，其中炮附片温肾助阳强心，配淫羊藿、 菟丝子以加强补肾温阳作用，党参益气健脾启枢，合茯苓、白术、陈皮、甘草理气健脾利水共助开启中焦枢机，此8味药物即为补肾启枢治法的核心药物组成。运用现代科学技术与方法揭示中医理论的科学内涵是当今中医药研究的重要内容之一，而将理论梳理与方药分析相结合的研究方式是丰富和发展中医理论的有效途径[2]。研究拟在阐释补肾启枢法中医理论内涵的基础上，运用网络药理学的研究方法分析补肾启枢强心颗粒治疗慢性心力衰竭的分子作用机制，进而揭示补肾启枢法的现代内涵。

1 补肾启枢法概述

1.1 心与脾肾的生理联系心与脾、肾在生理上彼此之间联系紧密。心居胸中，处上，属阳，五行属火，肾居腰府，处下，属阴，五行属水，二者为水火之脏。心与肾在生理上的联系主要表现为心肾相交，即正常生理状况下，心与肾在阴阳、气血、精神方面全面交感，彼此协调，保持动态平衡，使机体处于阴平阳秘的状态。首先，心肾上下交通协调，共同维持机体阴阳平衡的状态。心属火脏，为阳中之阳，肾水(阴)在肾阳鼓动下蒸腾于上，以使心火不亢；肾属水脏，为阴中之阴，心火(阳)赖心阴之凉润而下行助肾，以使肾水不寒。其次，心与肾为阴阳水火之脏，相互为用。心为阳脏，主阳气，《血证论》言：“心为火脏，烛照万物”，此言心之阳气推动血液运行，温煦人体，营养周身，而肾阳之温煦蒸腾亦有赖于心阳的温化作用；肾藏先天之精，而由其分化而来的肾阴肾阳为一身阴阳之根本，故生理上，心本乎肾，心气心阳源于肾，有赖于肾气肾阳之温煦。最后，心与肾精神互用，心之藏神与肾之藏精生理上联系紧密，盖精能化气生神，而神能控精驭气，相互为用则神守志清。心属火，脾属土，为母子之脏，生理上，二者的联系主要表现为：①心与脾在血液生成上相互为用。脾为后天之本，气血生化之源，饮食水谷经脾胃运化而产生的水谷之精是血液化生的物质基础，水谷之精化生的营气和津液需经心火(心阳)作用方可转化为血液，即《血证论·阴阳水火气血论》所言：“食气入胃，脾经化汁，上奉心火，心火得之，变化而赤，是之谓血”。②心与脾功能上相互助益。心属火，以阳气为用，且和脾为母子之脏，心阳温煦脾阳，可助脾胃腐熟运化水谷精微；脾胃居中焦，为气机升降枢纽，而心与肾之间的上下交通协调亦需要气机的调畅，正如《慎斋遗书》所言:“心肾相交,全凭升降”。③心与脾在血液运行上相互协调，心主行血为血液运行提供动力，脾主统血以使血行脉中不溢出，其共同维持血液的正常运行。

1.2 病在心 五脏相关 重在脾肾心衰属本虚标实、虚实夹杂之证，“病位在心，五脏相关”是其重要病机特点，其中又以脾肾与之关系更为密切。心衰作为一种渐进性发展的慢性疾病，病程长，迁延不愈，日久必损伤正气。且疾病过程中痰饮、水湿、瘀血，病理产物的蓄积又会进一步耗伤正气，病愈久则正气愈虚，故心衰之本在于正气亏虚。而肾藏精，主生长发育，为先天之本；脾主运化，气血生化之源，为后天之本，人体正气亏虚与脾肾密切相关。心与脾为母子之脏，心衰疾病进展过程中常可见到母病及子的情况，即心之气阳亏虚为甚，不能温煦脾阳而致脾运化失权、湿浊内蕴、营血化源不足。临床中心衰患者常因心功能减退伴有胃肠道瘀血而出现消化道症状即是佐证。心病及脾，中焦脾胃运化失权，则气血化生乏源，以致心血不足，脉道空虚，进而影响心脏的搏动和血液运行；同时脾胃居中焦，为气机升降枢纽，在水液代谢中起枢转作用，而脾胃运化失权则水液的上腾下达受阻，易酿湿成浊化痰，邪阻于内，脉道不利，则进一步影响心主血脉功能。心与肾为阴阳水火之脏，两者上下交通协调的失衡常可打破人体阴平阳秘的状态。慢性心衰至后期，可见心阳亏虚累及肾阳而出现肾阳亏虚，而肾阳虚惫又导致心阳无以为根，终致心肾阳虚之证，阳虚感寒，水湿无以温化，泛溢肌肤则见肢体浮肿，水饮上泛凌心可见喘促不能平卧。此外肾阳不足而蒸腾作用的减弱导致肾水不能上济于心，进而出现心烦、心悸、不寐等心火虚亢的表现。

1.3 补肾启枢治法内涵补肾启枢治法是江西中医药大学刘中勇教授在多年辨治慢性心力衰竭的基础上，总结分析、提炼病机而提出。刘中勇教授认为，慢性心衰为本虚标实之证，病位在心，与其余四脏均有关联，但心与脾肾在病理生理联系紧密，故重在脾肾。因此慢性心衰的治疗当重在补虚，勿忘泻实，治当从脾肾始之，补肾温阳以利水、运脾启枢以安四脏[1]。具体而言，治从脾肾，一可调补心之气血阴阳亏虚，扶人体正气。心本乎肾，心气心阳源于肾，赖肾气肾阳以温煦，故温补肾气肾阳，则心阳可通；脾为后天之本，气血生化之源，脾旺则气血调和，真气充沛，以维持心血充盈；同时脾肾各为先后天之本，相互资生，温肾阳可振奋脾阳，促进水谷运化，脾旺气血充沛，可充养和培育肾精。另一方面，治从脾肾可促进机体水液代谢去标实。温补肾阳可助下焦肾与膀胱气化，利水消肿；脾处中焦，水液的上腾下达，有赖于脾气的枢转，启枢即健脾，有醒脾、动脾之意，中焦得运则有助于水湿代谢，杜绝生痰之源，同时可向下助肾与膀胱气化，使水湿下达而出。

2 补肾启枢治法的分子作用机制探讨

2.1 资料来源研究数据来源于TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，STRING 11.0平台(https://string-db.org/cgi/input.pl)及Metascape 数据库(https://metascape.org/gp/index.html)。

2.2 研究方法①首先在 TCMSP数据库中以口服生物利用度大于30%及类药性大于0.18为标准，筛选炮附片、淫羊藿、菟丝子、党参、茯苓、白术、陈皮、甘草的活性成分，同时收集上述活性成分的对应靶点；②在GeneCards数据库中以“ Chronic heart failure” 及“Congestive heart failure” 为关键词检索慢性心力衰竭的相关靶点；③在Excel 2019中，对药物活性成分及疾病靶点取交集，获得药物与疾病的共同作用靶点；④将交集靶点导入STRING 11.0平台构建PPI网络筛选核心靶点；⑤在Metascape 数据库中对交集靶点进行GO功能及KEGG 通路富集分析。

3 结果

3.1 药物成分及靶点筛选通过TCMSP数据库筛选得到炮附片、党参、菟丝子等8味中药潜在活性成分共137个，对应靶点去重后共220个。在GeneCards数据库中经关键词检索共获得10986个疾病靶点，保留Relevance score>5.21(中位数)且GIFtS>42(中位数)的疾病靶点，最后获得2924个相关度较高的靶点。运用Excel 2019对药物靶点及疾病靶点取交集，共获得交集靶点220个。

3.2 交集靶点的PPI网络将220个交集靶点导入String平台进行PPI网络分析，置信度设置为“High confidence”，获得的PPI网络包含212个节点，1815条边。经统计，靶点蛋白平均节点度值为 17.12，超过平均度值的靶点蛋白共有72个，度值排名前20靶点见表1。研究显示白介素家族成员(如IL-1β、IL-6)及TNF-α在内的炎性因子在心肌纤维化过程中起促进作用，可通过作用于纤维状前胶原α、下游信号通路NF-κB、JAK-STAT、Ras/Raf等增加多种基质金属蛋白酶(MMP)的蛋白水平[3]。p53蛋白是一种研究较为广泛的肿瘤抑制因子，现有研究显示其通过氧化应激、细胞自噬与凋亡、内质网应激引发的线粒体损伤等参与心衰的病理过程。例如p53蛋白的活化可引起Bax基因的转录上调，抑制Bcl-2基因的表达，从而促进心肌细胞的凋亡[4]。此外有研究还表明p53有助于调节线粒体和内质网相互作用，在缺血再灌注损伤诱导内质网应激的小鼠中将其p53蛋白基因敲除，可观测到线粒体的保护及心肌细胞损伤的减少[5]。CASP3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，为凋亡级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶[6]。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调节不同组织中的多种细胞功能。研究表明[7]，在心脏中AKT1的短期激活可促进生理性肥大，而长期AKT1激活可引起病理性肥大，且AKT 的短期激活通过抑制细胞凋亡的发生以及抑制 FOXO3a 效应子BNIP3启动线粒体自噬而产生有益作用。在心肌细胞中，STAT3可促进心肌分化、血管成分形成和细胞外基质稳态，STAT3 的活化还可保护心肌免受缺血/再灌注损伤[8]。从文献分析可以看出这些蛋白涉及炎症反应、心肌纤维化、心肌凋亡、细胞自噬、氧化应激等方面。推测上述靶点蛋白可能是 PPI 网络中的关键靶点，补肾启枢强心颗粒的网络调节效应很可能是通过作用于这些靶点得以发挥。

表1 PPI网络核心靶点蛋白信息

3.3 GO功能及KEGG 通路富集分析将上述得到的220个相关靶点导入Metascape平台进行GO及KEGG功能富集分析。见图1，表2。KEGG通路富集分析筛选获得前10条相关通路，结合文献查证分析后发现，这些通路涉及心肌纤维化、氧化应激、细胞凋亡、心肌能量代谢等病理生理机制。有研究显示，Toll样受体信号通路与心肌自噬水平相关，研究者在心梗小鼠实验中将通路中关键靶点TLR3敲除，观测到了心肌自噬水平的抑制以及心肌梗死面积减少[9]。AGEs(晚期糖基化终末产物)在体内蓄积引发的氧化应激及系统微炎症可诱导心肌纤维化的发生，是糖尿病心肌病患者心功能恶化的重要原因[10]。PI3K-Akt信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路，与细胞凋亡的信号调节相关，AKT的活化可直接抑制BAD等促凋亡蛋白活性或FoxO等转录因子产生的促凋亡信号,从而起到抑制心肌凋亡的作用[11,12]。HIF-1 信号通路同样与细胞凋亡相关，作为PI3K-AKT的下游信号通路，AKT1的活化可增加HIF-1α表达而对缺氧导致的心肌凋亡起到抑制作用[13]。环磷腺苷(cAMP)信号与心肌收缩力相关，β1-AR/β2-AR的激活可上调cAMP的表达，cAMP 激活PKA，进而磷酸化心肌细胞的相关调节蛋而增强心肌收缩力，起到正性肌力作用[14]。PPAR及AMPK信号通路与心肌细胞的能量代谢调节相关，研究显示，PPAR-α及AMPK可在基因转录水平上对能量代谢的进行调节，上调PPAR-α/AMPK信号通路的表达， 可促进线粒体的生物发生，从而改善衰竭心脏的能量代谢,延缓心衰进展[15]。

表2 KEGG通路富集分析结果

图1 GO 生物学过程分析(Biological process)、 GO 细胞组分分析(Cellular component)、GO 分子功能分析 (Molecular function)

GO功能注释获得相关条目28条。GO-BP(生物过程)涉及炎症反应、活性氧代谢过程、凋亡信号通路的调节、MAPK级联反应的调控、循环系统中的血管过程等；GO-CC(细胞组分)涉及细胞质囊泡内腔、内质网腔、溶酶体、线粒体外膜、RNA聚合酶II转录调节复合物、Bcl-2家族蛋白复合物、蛋白激酶复合物等；GO-MF(分子功能)涉及氧化还原酶活性、蛋白质结构域特异性结合、血红素结合、肾上腺素受体活性、儿茶酚胺结合。上述GO功能注释条目提示处方的调控效应与循环过程中的心血管效应、细胞凋亡、能量代谢相关。

4 结语

补肾启枢治法是江西中医药大学刘中勇教授在多年的慢性心衰辨治基础上提出的，其立法选药整体契合于慢性心衰本虚标实的病因病机。此研究对补肾启枢治法的理论内涵作初步分析，同时结合生物信息学的方法对补肾启枢治法的现代科学内涵作了初步探讨。研究结果显示补肾启枢法治疗慢性心力衰竭涉及的机制包括心肌纤维化、氧化应激、细胞的自噬与凋亡、心肌能量代谢等。心肌纤维化是心力衰竭进展的必然过程，延缓心肌纤维化的进展对维持心脏的收缩舒张功能极为关键。心肌细胞自噬与凋亡是心肌缺血、缺血再灌注、压力超负荷诱导心肌肥厚和心力衰竭时所发生的病理、生理改变。正常范围内的自噬与凋亡可以维持人体细胞的正常生理机能，但自噬与凋亡的水平过高和过低则会引发疾病。在心衰疾病进展过程中，心肌细胞的能量代谢在底物利用方式及中间代谢过程发生紊乱，使心肌细胞产能受到限制，无法维持机体在日常活动中心肌所需的能量供给，从而影响了心脏的收缩、舒张功能。本研究结果表明补肾启枢强心颗粒可能通过作用于TP53、IL-1β、IL-6、TNF-α、AKT1、STAT3等靶点，调控Toll样受体、PI3K-Akt、HIF-1、cAMP、PPAR及AMPK等信号通路，从而起到抗心肌纤维化、调控心肌细胞自噬与凋亡、改善心肌能量代谢的作用。结果对明晰补肾启枢治法的科学内涵具有借鉴意义，但所得结论仍需进一步研究验证。