稚儿灵颗粒HPLC 指纹图谱及多指标成分的含量测定

李 佳，王 玉，金 华

淮安市食品药品检验所，淮安 223300

稚儿灵颗粒是一种复方中成药，由著名的古方参苓白术散、归脾汤、八珍汤合方化裁而成，该制剂由党参、太子参、南沙参、白术（麸炒）、白芍（麸炒）、制何首乌、木香、陈皮、甘草等24 味中药材组成；方中诸药合用，全方共奏益气健脾、补脑强身之功效[1]。用于小儿厌食，面黄体弱，夜寝不宁，睡后盗汗等症，且在治疗迁延性腹泻上取得满意疗效。稚儿灵颗粒作为儿科临床常用药物，目前对其化学成分的研究报道很少，江晓等[2]曾研究稚儿灵颗粒质量标准；但仅对橙皮苷单一成分进行了分析。

由于稚儿灵颗粒为复方制剂，成分复杂，单一测定某种成分的含量，不足已综合反映其整体质量。而目前指纹图谱技术是一种多组分复杂样品的质量控制方法，可以反映出待测样品的特征性和整体性[3，4]，被国内外广泛接受和采纳，可以作为质量控制和药物评价的手段之一[5,6]。

目前关于稚儿灵颗粒的指纹图谱研究尚未见报道，据此，对稚儿灵颗粒开展HPLC 指纹图谱研究[7,8]，对5 个厂家的19 批样品进行相似度分析，并对其共有峰进行来源归属和化学成分的指认，同时测定其中4 种有效成分的含量，为稚儿灵颗粒的系统评价和质量控制提供试验依据。

1 材 料

1.1 仪器

UltiMate3000 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；Aglient 1260 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；XS205DU 十万分之一分析天平；KH7200DE 型数控超声波清洗器。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品没食子酸（批号：110831-201605，质量分数90.8%）﹑芍药苷（批号：110736-201337，质量分数94.9%）﹑橙皮苷（批号：110721-201318，质量分数95.3%）﹑甘草苷（批号：111610-201908，质量分数95.0%）均购自于中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷（39011-90-0,质量分数98.0%）购自于上海标准技术中心。

1.2.2 供试品见表1。

表1 样品信息

1.2.3 试剂乙腈﹑甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

1.3 药材饮片

白芍（麸炒）﹑陈皮﹑木香﹑甘草（蜜炙）均为市售药材，经本所中药室鉴定品种正确。

2 方法与结果

2.1 本品指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。流动相A 为乙腈，流动相B 为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱程序：0～10min，1%A，99%B；10～35 min，1%～24%A，99%～76%B；35～45min，24%～38%A，76%～62%B；45～50min，38%～1%A，62%～99%B。

2.1.2 混合对照品溶液制备分别精密称取没食子酸对照品10.66 mg、芍药苷对照品20.38 mg﹑芍药内酯苷对照品9.89 mg﹑橙皮苷对照品18.04 mg﹑甘草苷对照品10.26 mg，分别置于10 mL 量瓶中，作为各对照品贮备液；分别精密吸取上述各储备液各1 mL，置于同一50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备取本品1 袋，研细，精密称取粉末6 g，置具塞三角瓶中，加入稀乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声振荡处理（700 W，40 kHz）45 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.1.4 单味药材溶液制备分别称取白芍（麸炒）、陈皮、木香、甘草（蜜炙）药材适量，按“2.1.3”项下方法制成单味药材溶液。

2.1.5 阴性对照溶液制备精密称取缺白芍（麸炒）、陈皮、木香、甘草（蜜炙）的样品，照“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.6 参照峰的选择在稚儿灵颗粒指纹图谱中，芍药苷峰和橙皮苷峰大小适中且稳定，与相邻峰达到完全分离，对称性较好；但由于橙皮苷出峰时间较晚，位于整个色谱图的后半部，故考虑选择芍药苷峰为参照峰。在以下方法学考察中均以各供试品溶液色谱图中芍药苷峰的保留时间和峰面积值为参照，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.1.7 精密度试验取稚儿灵颗粒S1 号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录60 min 的色谱图。以芍药苷峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间，RSD均小于2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验取稚儿灵颗粒S1 号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6 份，以芍药苷峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间，RSD 均小于2.0%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.1.9 稳定性试验取稚儿灵颗粒S1 号样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进样检测，分别记录60 min 的色谱图。以芍药苷峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间，RSD 均小于2.0%（n=6）,表明该供试品溶液在24 h 内稳定。

2.1.10 指纹图谱的建立及相似度计算取19 批稚儿灵颗粒，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录60 min 的色谱图。采用 “中药色谱指纹图谱相似度评价软件”2012 版（国家药典委员会），以S1 为参照谱，采用多点校正后进行Mark 峰匹配，生成指纹图谱共有模式，根据匹配结果共标定了10 个峰，得到19 批稚儿灵颗粒的HPLC 指纹图谱及对照指纹图谱，标记为S1～S19，见图1、图2。同时对19 批样品的指纹图谱进行相似度评价计算，结果S1～S19 的相似度均大于0.90。

图1 稚儿灵颗粒在230 nm 下的HPLC-PDA 指纹图谱

2.1.11 共有峰的指认及特征峰的药材归属分别取供试品溶液和对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录60 min 色谱图；在230 nm 波长处测定芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷对照品溶液，其保留时间和紫外光谱与图2 中3、4、5、9 峰相对应。共有峰的标定以（4 号）芍药苷色谱峰为参照，计算样品的10 个共有峰的相对保留时间、相对峰面积值，10 个峰的相对保留时间的RSD 值在0.2%～1.0%。10 个共有峰中1﹑3﹑4 号峰来源于白芍（麸炒），5 号峰来源于甘草，9 号峰来源于陈皮。

图2 19 批稚儿灵颗粒的指纹图谱及对照指纹图谱

2.2 4 种成分的含量测定

2.2.1 供试品溶液制备供试品溶液的制备同“2.1.3”项，混合对照品溶液的制备同“2.1.2”项。

2.2.2 色谱条件色谱条件同“2.1.1”项。

2.2.3 系统适用性要求取上述混合对照品溶液、供试品溶液（编号S1）和空白溶液（甲醇）适量，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果各待测组分与前后色谱峰分离度均＞1.5，对称因子在1.05～1.30，理论板数以芍药苷峰计＞5000。阴性溶液对测定4 种成分无干扰。见图3。

图3 稚儿灵颗粒高效液相色谱图

2.2.4 线性关系考察分别精密吸取“2.1.2”项下各对照品储备液适量，分别置于50 mL 量瓶中，加甲醇定容，混匀，得系列线性工作溶液；精密吸取上述系列线性工作溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以各待测成分的质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标、以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

表2 芍药苷等4 种有效成分的回归方程与线性范围

2.2.5 精密度试验取“2.2.4”项下混合系列线性工作溶液（芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷的质量浓度分别为19.384 4、38.681 2、19.494 0、34.384 2 μg·mL-1）适量，按“2.2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷的峰面积的RSD 分别为0.97%、0.60%、1.06%、0.48%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验取稚儿灵颗粒样品（编号S1）6g，共6 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。结果芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷含量的RSD 分别为1.71%、0.93%、1.16%、0.54%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验取“2.2.1”项下供试品溶液（编号S1）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷峰面积的RSD 分别为1.53%、0.61%、1.55%、0.38%（n＝8），表明供试品溶液于室温下放置24 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验取已知含量的稚儿灵颗粒（编号S1）细粉约3 g，共9 份，分成3 组，精密称定后，分别按样品与对照品l∶0.5、l∶l、l∶1.5 的比例加入各对照品储备液，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并按外标法对照品比较法计算各成分加样回收率及RSD。结果稚儿灵颗粒中芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷的平均回收率分别为96.7%、97.9%、98.8%、103.2%，RSD 分别为1.1%、0.8%、1.5%、0.6%（n=6）。

2.2.9 耐用性试验取稚儿灵颗粒样品（编号S1），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别以不同仪器（Aglient 1260 高效液相色谱仪）﹑不同色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱）进样测定，记录4个成分的峰面积。结果表明，各共有峰的相对峰面积RSD 均＜2.0%，表明耐用性较好。

2.2.10 样品含量测定取19 批稚儿灵颗粒样品粉末，每份约6 g，共2 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法对照品比较法计算各样品含量。每份样品平行操作2 次，取平均值。见表3。

表3 19 批稚儿灵颗粒样品中芍药苷等4 种有效成分的含量测定结果（n=2，mg·g-1）

2.3 聚类分析

在19 批稚儿灵颗粒指纹图谱中，以测定的10个共有峰的峰面积为变量，采用IBM SPSS22.0 软件进行分析，以Pearson 相关性为测度，采用组间联接法绘制聚类分析图，见图4。

图4 19 批稚儿灵颗粒样品的聚类分析图

由图4 可知，当类间距为5 时，19 批样品可聚为四类：S1﹑S2﹑S7 为一类；S3～S6 为一类；S8～S10 为一类；S11～S19 为一类。第一类为广东元宁制药和华润三九制药；第二类为广西万寿堂制药；第三类为贵州远程制药；第四类为吉林省康福药业。由此看出，同一厂家不同批次间的产品质量有较高的稳定性，不同厂家之间还存在差异。

3 讨论

指纹图谱技术能全面反映中药的内在化学特征，具有整体性和模糊性特点，已成为控制中药质量的最有效手段。本研究对5 个厂家19 批稚儿灵颗粒进行了部分成分指纹图谱比较，结果表明，19批稚儿灵颗粒的HPLC 图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.90，表明不同厂家生产的稚儿灵颗粒的化学成分相似，使用的药材及生产工艺较为稳定，一致性较好。含量测定结果显示，芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、橙皮苷等4 种成分含量的RSD 分别为58.3%、54.9%、43.9%、44.8%，表明不同厂家的稚儿灵颗粒质量存在一定差异，这可能与原药材基原的多样性和复杂性有关，包括土壤、气候等自然条件。贵州远程制药的各成分含量均明显高于其它企业，提示该企业在原料的选择和工艺的流程设计上有明显的优势。

综上所述，所建指纹图谱稳定、可行，含量测定方法简便、准确、重复性好，此方法可用于稚儿灵颗粒的质量控制。