痔宁片等5 种含槐花/米中成药中黄酮类成分测定研究

马旭倩，王李杰，陆宇婷，宋 敏，德拉姆皮埃尔，杭太俊*

1 中国药科大学 药学院，南京 211198；2 中国药科大学 理学院，南京 211198

痔疮是发病率较高的常见疾病，采用中医药遵循辨证论治原则，对于轻中度痔疮的预防和治疗，效果良好[1，2]。痔宁片、地榆槐角丸、槐角丸、痔康片和槐花散是中医治疗痔疮下血证的5 种常用中药制剂（见表1），处方中都含有槐花或槐米，再辅以黄芩、枳壳等其他药味，均含有芦丁等黄酮类特征有效成分[3-6]，起到凉血止血、修复创面、清肝泻火的痔疮治疗作用。

表1 5 种治疗痔疮中成药的特征信息

在这些治疗痔疮的中药制剂中，《中国药典》2020 版质量标准除有特征成分鉴别外，大都仅对个别特征成分进行含量测定与控制[7]。

本研究以痔宁片、痔康片、地榆槐角丸、槐角丸和槐花散5 种含槐花/米中成药为对象，建立痔疮治疗相关黄酮类特征成分的HPLC 检测方法，并结合对照品对照与Q-TOF/MS 进行了鉴定，可为含相同药材的中药制剂的质量控制研究提供参考[8]。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Shimadzu LC-2010CHT 和9030 Q-TOF/MS 液质联用仪（日本Shimadzu 公司）；BS 21S 分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ 5200DB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；PB-10 普及型pH 计（德国Sartorius 公司）

1.2 药品与试剂

黄酮类7 种对照品：芦丁对照品（含量：91.6%，批号：100080-202012）、黄芩苷对照品（含量：94.2%，批号：110715-202122）、山奈酚-3-O-芸香苷对照品（含量：90.8%，批号：112007-201602）、水仙苷对照品（含量：93.1%，批号：111997-201501）、黄芩素对照品（含量：97.9%，批号：111595-201808）均来源于中国食品药品检定研究院；柚皮苷对照品（含量＞98%，批号：MUST-21032803，成都曼斯特生物科技有限公司）；新橙皮苷对照品（量＞98%，批号：RFSX01001908012，成都瑞芬思生物科技有限公司）。

甲醇、乙酸为分析纯；乙腈为色谱纯；自制超纯水。

3 种中药配方颗粒：炒槐花、麸炒枳壳、黄芩（含量：每克相当于10 g 饮片，批号：20210704）均由江苏省中医院配制、江阴天江药业有限公司生产。槐米中药饮片（批号：20210704）购于江苏省中医院。

痔宁片（规格：每片0.4 g；批号：2002007N，华润三九（郴州）制药公司）；痔康片（规格：每片0.3 g；批号：20061012，江中药业）；地榆槐角丸（规格：每丸0.1 g；批号：19035278，北京同仁堂制药厂）；槐角丸（规格：每丸0.05 g；批号：20040006，重庆桐君阁药厂）；槐花散（规格：每袋5.6 g；批号：20 210422；永乐滋食品店）。

2 方 法

2.1 色谱条件与系统适用性试验

采用Agilent C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相A 为乙酸水溶液（pH=3.0），流动相B 为乙腈，梯度洗脱程序（A:B）：0 min（88:12）→25min（82:18）→45min（60:40）→46min（88:12）→50min（88:12）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；检测波长为280 nm；进样盘温度25 ℃；进样量10 μL。

理论板数按所测主成分峰计算均应不低于3000，分离度均应大于1.5，拖尾因子应在0.9～1.1。

2.2 质谱条件

电喷雾负离子检测模式，接口电压3.0 kV，离子源温度300 ℃，雾化气（氮气）流速3.0 L·min-1，加热气（干空气）和干燥气（氮气）流速均为10.0 L·min-1。质量数扫描范围m/z 50～1000 Da。二级质谱扫描氩气CID 能量范围5.0～40 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 对照品溶液分别取芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、山奈酚-3-O-芸香苷、水仙苷、黄芩素对照品各适量，精密称定，置于同一量瓶，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度依次约为80、20、10、20、10、10、10 μg·mL-1的混合定性对照品溶液。

分别取芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的对照品适量，精密称定，按照上述方法配制，制得质量浓度依次约为800、200、100、200 μg·mL-1的混合定量对照品溶液。

2.3.2 对照药材溶液取槐米、炒槐花颗粒、麸炒枳壳颗粒、黄芩颗粒，研细，精密称取适量，分别置于不同量瓶中，加适量甲醇，超声提取30 min，放冷，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别约为500、500、200、100 μg·mL-1的溶液，分别滤过，取续滤液作为单一对照药材溶液。

2.3.3 供试品溶液取痔宁片、痔康片各10 片，除去薄膜衣；或取地榆槐角丸、槐角丸各40 丸，剪碎，研细；或取槐花散，研细。按照上述单一对照药材方法，配制质量浓度分别为2.4、1.5、2.0、2.0、2.0 mg·mL-1的供试品溶液。

3 结果

3.1 定性鉴定

分别取槐米、炒槐花、麸炒枳壳、黄芩等4 种单一对照药材溶液、混合定性对照品溶液、痔宁片供试品溶液，按“2.1”色谱条件和“2.2”质谱条件进样测定。

结果如图1、图2 和表2 所示。与对照药材比较，确认痔宁片中含有分别与槐米、枳壳、黄芩药材相关的黄酮类特征成分[9，10]，并进一步结合Q-TOF/MS 鉴定和对照品对照，确定痔宁片中黄酮类特征成分峰（编号1～8）依次为：芦丁、山奈酚-3-O-芸香苷、水仙苷、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素（化学结构见图3）。

表2 痔宁片中8 种黄酮类组分的Q-TOF/MS 液质联用鉴定结果

图1 痔宁片及对照溶液的典型色谱图谱

图2 痔宁片中Q-TOF/MS 鉴定的八种黄酮类成分的母离子和子离子质谱图

图3 痔宁片中8 种黄酮类成分的化学结构

3.2 定量方法

根据2020 版《中国药典》第四部9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”[7]，对痔宁片中相对含量较高的芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷进行定量分析方法学验证，验证指标主要包括专属性、线性范围、检测限、定量限、准确度、精密度和耐用性。

3.2.1 专属性分别取槐米、炒槐花、麸炒枳壳、黄芩颗粒溶液、混合对照品溶液、痔宁片供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

结果显示（图1），芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷这4 种成分均分离良好，测定结果不受干扰，表明专属性良好。

3.2.2 线性范围精密量取混合定量对照品溶液适量，用50%甲醇定量稀释制成相当于原液浓度：1%、2%、5%、10%、15%、20%、50%的系列混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积（Area）为纵坐标（Y），质量浓度C（μg·mL-1）为横坐标（X），进行线性回归。结果在系列浓度范围内，4种成分均线性关系良好（r2均＞0.999）。见表3。

3.2.3 检测限和定量限根据《中国药典》2020 版通则9101 中“响应值标准偏差和标准曲线斜率法”分别计算检测限和定量限。平行配制6 份定量限溶液，1 份检测限溶液，依法进样分析。结果显示该方法灵敏度良好。见表3。

表3 痔宁片4 种黄酮类化合物HPLC-UV 测定的线性范围和灵敏度

3.2.4 准确度和精密度取痔宁片粉末约24 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加入2 mL 甲醇超声处理后，再精密添加混合定量对照品溶液0.5、1.0或1.5 mL，50%甲醇稀释定容，即制得50%（低浓度）、100%（中浓度）、150%（高浓度）的加样回收率试验溶液，每个浓度各制备3 份；同时，不取痔宁片粉末，同法配制低、中、高浓度的对照品溶液；照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各组分峰面积。并根据外标标准曲线计算各成分的本底值、实测值和加样回收率（%）及RSD%。见表4。

表4 痔宁片中四种黄酮类成分的回收率和精密度（n=3）

各组分的平均回收率在93%～99%，RSD%平均在0.6%～4.4%，表明该方法准确度和重复性良好。

3.2.5 耐用性通过改变流速、柱温、pH 和不同色谱柱等条件，进样测定。结果显示，上述改变均能在一定条件下满足系统适用性要求，方法可靠。

3.2.6 含量测定按照“2.3”项下方法配制供试品溶液和混合定量对照品溶液各2 份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按对照品比较法计算5 种中药制剂中4 个成分（芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷）的含量。

结果（图4 和表5）与《中国药典》标准（表1）相比，痔宁片和痔康片中芦丁含量分别约为药典标准的1.6 倍和2 倍；槐角丸中柚皮苷和黄芩苷量分别约为药典标准的3.8 倍和1.5 倍。均满足含量测定要求。另外，文献[11，12]记载痔康片中每片芦丁含量在6～8 mg，与本研究结果基本一致。

表5 五种含槐米/花痔疮治疗中成药中黄酮类特征成分含量的HPLC 测定结果

图4 5 种含槐米/花中成药中黄酮类特征成分HPLC 测定典型色谱图

4 讨论

基于国内外药典和文献条件，建立了5 种痔疮治疗制剂的多指标同时定量方法并进行了方法学验证。结果表明，该方法专属性强、灵敏度适宜、线性范围宽、准确可靠。以痔宁片为代表，对其特征黄酮类药味成分同时采用对照品结合LC-PDA-QTOF/MS 鉴定，保障了5 种痔疮治疗制剂中多个黄酮类成分质量控制的可靠性。

槐花/米作为主要治疗药物的君药，与黄芩、枳壳等共同配伍进行辩证治疗。参考中药质量标志物，以君臣佐使的组方原则，将芦丁、黄芩苷、柚皮苷、新橙皮苷这4 种黄酮类化合物确定为其关键性指标成分，可以实现对这些复方中药的质量控制。