AlCl3促进毛竹低共熔体系预处理效率的研究

程金元， 詹云妮， 黄 晨,2， 邓拥军,2， 房桂干,2*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业和 草原局林产化学工程重点实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室,江苏 南京 210042；2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210037)

随着世界经济的不断发展，社会对能源的需求越来越大，由此引发的能源短缺和环境污染等问题日趋严重，迫使人类寻求一种清洁、可再生的新型能源[1-3]。木质纤维生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源，利用木质纤维原料制备燃料乙醇是生物质能源转化的重要方式，同时也是解决能源危机和环境污染问题的途径之一[4]。木质纤维原料制备燃料乙醇主要包含预处理、酶水解和发酵等关键步骤。木质纤维原料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中半纤维素和木质素紧密包裹纤维素，形成制约纤维素发酵的天然屏障，使得纤维素难以被有效地发酵[5]，因此，对木质纤维生物质进行生物炼制，首先需要进行预处理。常用的预处理方法有物理法、化学法、生物法等，化学法是目前最为常用的预处理技术，通过化学药剂处理木质纤维原料以实现木质纤维原料中纤维素、半纤维素、木质素等组分的有效分离，提高预处理底物的纤维素可及性，但化学法预处理存在反应温度高、化学品回收难、污染严重等问题，限制了其大规模应用，亟需寻求一种清洁、可回收的预处理溶剂[6]。低共熔溶剂(DES)作为一种环保、价格低廉、易制备、热稳定性好、可循环使用的绿色溶剂，近年来逐渐成为研究热点，其可以在较低温度下有效实现纤维素、半纤维素、木质素的分离，大幅提高预处理物料发酵效率[7]。DES体系能够与木质纤维素组分形成强分子间氢键作用，从而竞争木质纤维原料自身的氢键，实现木质纤维原料组分分离[8]。DES体系由氢键供体和氢键受体组成，其中氢键受体主要有氯化胆碱、脯氨酸、甜菜碱等;常用的氢键供体包括多元醇(乙二醇、甘油等)，有机酸(乳酸、草酸等)，氨基化合物(尿素、氨基酸等)和酚类化合物(香兰素、对香豆酸等)等。近年来，科学界逐渐形成共识，即采用木质纤维原料来源的化合物(愈创木酚等)作为DES的氢键供体，可实现资源循环利用和可持续发展。生物基来源的乳酸、草酸等制备的DES体系对生物质预处理已有较好的效果，但在有机醇类(甘油、乙二醇等)及部分木质素衍生物类(香草醛、对羟基苯甲酸等)等供氢较弱的体系中，形成的DES对木质纤维原料的处理效果较差。本研究采用的氢键供体为愈创木酚，由于愈创木酚供氢能力弱，氯化胆碱和愈创木酚形成的DES体系对毛竹的预处理效果较差，向该DES体系中添加微量AlCl3,探讨了AlCl3对DES体系的促进机制，以期为木质纤维素基DES体系的构建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

毛竹由浙江仙鹤纸业有限公司提供，毛竹的主要组成(质量分数计)：葡聚糖41.00%，木聚糖12.78%，木质素30.99%，乙醇抽出物1.12%。纤维素酶(诺维信CTec 2)和木聚糖酶(诺维信X 2753)均购于Sigma-Aldrich(上海)公司，实测酶活力分别为250 FPU/g和3 490 U/g。AlCl3、氯化胆碱和愈创木酚，均为市售分析纯。

1.2 AlCl3辅助的低共熔溶剂预处理

毛竹竹片首先在自来水中浸泡过夜，浸泡后的竹片用双螺杆挤压机挤压后，再用GNM300盘磨机进行盘磨处理，盘磨间隙为0.2 mm，盘磨得到的竹纤维长度约为0.5～2 mm，盘磨后的原料经自然风干后测定水分并于密封袋中密封保存，备用。

AlCl3辅助的低共熔溶剂(DES)的制备在80 ℃油浴锅中进行，DES总质量为100 g。按不同物质的量(n氯化胆碱∶n愈创木酚∶nAlCl3为25 ∶50 ∶1、 25 ∶50 ∶0.8、 25 ∶50 ∶0.4、 25 ∶50 ∶0.2和25 ∶50 ∶0)称取氯化胆碱、愈创木酚和AlCl3至250 mL三角烧瓶中，于80 ℃油浴中不断搅拌，直至体系为澄清、透明状液体，经换算溶剂体系中AlCl3用量(摩尔分数，下同)为1.32%、 1.06%、 0.53%、 0。

准确称取相当于绝干10 g的风干毛竹(含水量10.24%)11.14 g于上述三角烧瓶中，将三口烧瓶转入至110 ℃油浴锅中搅拌反应1 h，反应结束后，将三角烧瓶从油浴锅中取出，反应混合物倒入250 mL丙酮水溶液(体积比1 ∶1)中终止反应，然后置于磁力搅拌器上搅拌4 h，再采用布氏漏斗进行固液分离，所得预处理物料(固液分离后含纤维素的固形物)置于4 ℃冰箱中储存、备用。

1.3 酶水解

称取相当于绝干0.5 g预处理物料于150 mL酶解瓶中，加入0.1 mL吐温80和0.04 mL 10 g/L四环素溶液，同时加入1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液1 mL，调节体系pH值至4.8左右。分别按酶用量25 FPU/g(以葡聚糖质量计)和150 U/g(以木聚糖质量计)加入纤维素酶和木聚糖酶，并补充适量去离子水使反应体系体积为20 mL。将酶解瓶置于50 ℃和150 r/min的摇床中反应72 h。酶水解结束后，取1 mL酶解样品沸水中高温灭活3 min，而后于10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度。预处理物料葡聚糖酶水解得率按公式(1)计算：

yc=m1×0.9/m2×100%

(1)

式中：yc—葡聚糖酶水解得率，%；m1—水解液中葡萄糖质量，g；m2—酶水解初始底物中葡聚糖质量，g。

1.4 分析方法

1.4.1毛竹化学组分分析 实验中物料葡聚糖、木聚糖和木质素(酸溶木质素和酸不溶木质素之和)质量分数均采用美国可再生能源实验室的标准方法测定[9]。

1.4.2物料得率和化学组分回收率分析 物料得率和组分回收率按式(2)和式(3)计算：

y=m3/m4×100%

(2)

r=m5/m6×100%

(3)

式中:y—物料得率，%；m3—预处理后物料质量，g；m4—初始物料质量，g；r—化学组分回收率，%；m5—预处理后物料中剩余各组分质量，g；m6—初始物料中各组分质量，g。

1.4.3单糖含量的测定 葡萄糖和木糖等可发酵糖浓度均采用Agilent 1260Ⅱ高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)测定，色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，柱温55 ℃，进样量10 μL；流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min，柱温55 ℃，检测器为示差折光检测器，检测器温度35 ℃。

1.4.4X射线衍射(XRD)分析 实验中样品的结晶度采用Advanced D8 X射线衍射仪(德国布鲁克公司)测定。仪器采用Cu Kα辐射源为X射线发射源，入射线波长为0.15 nm，测试过程中电压40 kV，电流40 mA。X射线发生器功率为3 kW，衍射角度2θ为10°～40°，扫描速率为2(°)/min，样品的结晶度按Segal提出的经验公式(4)计算。

ICr=(I002-Iam)/I002×100%

(4)

式中：I002—002晶格的极大衍射峰强度；Iam—无定形区背景衍射的散射峰强度。

1.4.5扫描电镜(SEM)分析 扫描电镜(SEM)分析前物料需进行冷冻干燥并用E-1010喷头进行表面喷金处理20 s，物料经喷金处理后采用3400-N扫描电镜(日本Hitachi公司)进行分析，电压为15 kV。

1.4.6红外光谱(FT-IR)分析 DES预处理前后物料的(FT-IR)分析采用TENSOR27红外光谱仪(德国布鲁克公司)进行分析，扫描波数为400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1，每个样本扫描32次。

2 结果与分析

2.1 预处理对毛竹化学组成及回收率的影响

采用供氢能力较弱的愈创木酚作为DES的氢供体，并加入微量AlCl3，实验设置5个不同的AlCl3用量梯度。随着AlCl3用量的增加，预处理后物料回收率、物料中各成分含量，以及预处理后物料葡聚糖、木聚糖回收率和木质素脱除率如表1所示。

表1 不同AlCl3用量低共熔溶剂预处理对竹材化学组分的影响Table 1 Effect of the different dosage of AlCl3 in DES on the content of the bamboo components

由表1可知，未添加AlCl3的DES中预处理物料回收率为95.10%，其中葡聚糖、木聚糖和木质素含量与毛竹原料相近，表明氯化胆碱/愈创木酚体系对毛竹预处理效果不显著。随着AlCl3的引入，预处理效率大幅上升，其中预处理物料得率从未添加AlCl3时的95.10%下降至57.16%，表明AlCl3用量的增加有利于竹材组分降解，具体表现为预处理物料葡聚糖、木聚糖、木质素含量发生不同程度的变化[9-10]，其中木聚糖和木质素质量分数分别从未添加AlCl3的12.58% 和28.87%降低到2.87%和13.62%，而葡聚糖的质量分数由42.31%增加到68.82%，表明随着AlCl3用量的增加，毛竹中的木质素和半纤维素降解越来越剧烈，而葡聚糖则比较稳定。在DES预处理体系中，未加入AlCl3的体系中形成的氢键较弱，不足以竞争木质纤维原料间的氢键；而AlCl3能够与氯化胆碱、愈创木酚的DES形成氯离子-金属阳离子-愈创木酚超分子配合物，增强了DES体系中的氢键作用，使木质纤维原料组分之间的氢键断裂而发生分离[11]。

图1 AlCl3用量对DES体系下 葡聚糖酶解率的影响Fig.1 Effect of AlCl3 dosage on glucan enzymatic hydrolysis yield in DES system

由表1可知，AlCl3用量为0.27%时，相较于未加入AlCl3的体系，木聚糖的回收率迅速降低，由93.65% 降低到31.29%，木质素脱除率迅速增加，由11.40%增加到54.39%，表明少量的AlCl3的加入可有效促进木聚糖和木质素的降解。随着AlCl3用量的增加，木聚糖和木质素的降解越来越严重，当AlCl3用量为1.32%时，木聚糖脱除率和木质素脱除率达到最大值，分别为87.16% 和74.88%。而葡聚糖回收率随着AlCl3用量的增加基本保持不变，始终在95%以上，表明本研究所用DES对纤维素的影响较小，表明氯化胆碱/愈创木酚/AlCl3体系能够实现木聚糖和木质素的大量降解，并同时保留几乎全部葡聚糖[12]。

2.2 预处理对酶解效果的影响

预处理物料的酶水解效率是评价预处理效果的关键指标，对不同AlCl3用量的DES预处理毛竹进行酶水解，并分析了酶水解得率与木聚糖和木质素脱除率的关系，结果如图1和图2所示。

由图1可知，未添加AlCl3的DES预处理竹材葡聚糖酶水解得率较低，仅为11.16%。AlCl3的加入对低共熔溶剂体系有明显促进作用，当添加少量AlCl3(用量为0.27%)，葡聚糖酶水解得率由11.16% 上升到68.37%，提高了57.21个百分点；随着AlCl3用量的进一步增加，葡聚糖酶水解得率也随之增加，当AlCl3用量为1.32%时，葡聚糖酶水解得率达到最大值96.20%，比未添加AlCl3的DES预处理毛竹增加了近8倍。葡聚糖酶水解得率的提高得益于预处理过程中木聚糖和木质素的去除，提高了纤维素的可及度。进一步研究了酶水解得率与木聚糖和木质素脱除率的关系，如图2所示，酶水解得率与木聚糖和木质素的脱除率均有很强的线性关系，R2分别为0.98和0.99，表明毛竹中木聚糖和木质素的去除均对酶水解有较强促进作用。

图2 木质素脱除率(a)和木聚糖脱除率(b)与酶水解得率的关系Fig.2 The relationship of lignin(a) and xylan(b) removal with the glucose enzymatic yield

2.3 预处理前后物料表征分析

2.3.1纤维素结晶度 为深入了解AlCl3的引入对DES预处理物料纤维结构的影响，测定了预处理前后物料纤维素结晶度，并比较了纤维素结晶度与葡聚糖酶水解得率的关系，结果如图3和图4所示。

图3 不同AlCl3用量预处理物料的XRD图 图4 葡聚糖酶水解得率与纤维素结晶度的关系

由图3及公式(4)经计算可知，毛竹原料的纤维素结晶度为59.59%，预处理物料纤维素结晶度随着AlCl3用量的提高而显著增加。未加AlCl3的DES中预处理后毛竹的结晶度与原料相近，为58.99%。随着AlCl3用量从0提高至1.32%，预处理物料纤维素结晶度从58.99%提高至61.31%、 61.91%、 62.83%和67.34%，这是因为在DES预处理过程中，非结晶态的木聚糖和木质素大量降解，使结晶区含量大幅增加[9]。由图4得出，预处理后毛竹的结晶度和酶水解得率存在一定程度的正相关性，R2为0.60，表明DES预处理物料纤维素结晶度并非影响葡聚糖酶水解得率的主要因素。在本研究体系中，葡聚糖酶水解得率的提高主要受木质素和半纤维素的脱除的影响，这两者的去除减少了其对纤维素的附着，增加了纤维素酶与纤维素的结合位点[13]。

2.3.2SEM分析 采用扫描电子显微镜观察原料及不同的AlCl3用量下的低共熔溶剂预处理毛竹纤维的微观结构，结果如图5所示。

由图5可知，原料毛竹的纤维较长，表面有少量分丝现象，可能是由于盘磨处理过程中的机械作用所致；与原料相似，未添加AlCl3的预处理物料纤维仍保持完整，并未发现明显变化；当AlCl3用量为0.27% 时，预处理物料纤维明显变短，并伴有纤维团聚现象[14-15]，这是因为纤维尺寸的变短以及木质素和半纤维素溶出使得纤维的比表面积增大，进而增加了纤维之间的氢键结合[16]。随着AlCl3用量的继续增加，纤维之间的团聚更加明显，当AlCl3用量为0.53%、 1.06%和1.32%时，SEM图已看不出单根纤维的存在。由SEM结果可以得出，预处理过程中毛竹切断多，纤维的比表面积增大，酶解过程中的酶结合位点增多，增加了纤维素酶与纤维素的吸附，进而提高了酶解得率。

a.原料raw material; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%图5 不同AlCl3用量预处理物料的扫描电镜图Fig.5 SEM images of materials pretreated with different AlCl3 dosage

a.原料raw meterial; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%图6 不同AlCl3用量预处理物料FT-IR图Fig.6 FT-IR spectra of materials pretreated with different AlCl3 dosage

经过DES预处理的物料，其红外谱图(曲线b～f)中1422和1367 cm-1处无明显变化，说明DES预处理过程纤维素的降解程度较小。随着AlCl3用量的增加，纤维素结晶区1101 cm-1处信号峰增强，表明纤维素结晶度增加；LCC吸收峰(1730 cm-1)逐渐减小，并且当AlCl3用量为1.32%时，1730 cm-1处的吸收峰消失，表明半纤维素降解严重；木质素在1507、 1602和833 cm-1处相关峰随着预处理强度不断增加，其信号逐渐减弱，说明木质素逐渐降解；木质素的紫丁香基吸收峰(1320 cm-1)在整个预处理过程中无明显变化，而愈创木基峰(1237 cm-1)则随着AlCl3用量的增加，强度逐渐降低，表明愈创木基有一定程度的减少，说明随着AlCl3用量的增加愈创木基在DES预处理过程中较紫丁香基更易于降解。

3 结 论

3.1DES氯化胆碱/愈创木酚体系对毛竹预处理无明显作用，而AlCl3的引入能够有效促进木聚糖和木质素降解，并能保留几乎全部葡聚糖。当AlCl3的用量从0增加到1.32%，半纤维素回收率从93.65%降低到12.84%，木质素脱除率由11.40%增加到74.88%。

3.2随着木聚糖和木质素的脱除，预处理物料酶水解性能大幅提高。未加AlCl3的DES预处理物料葡聚糖酶水解得率为11.16%；AlCl3的用量为1.32%时，预处理物料葡聚糖酶水解得率提高至96.20%，酶水解得率提高近8倍。

3.3经XRD、FT-IR和SEM分析可知，纤维素结晶度并非影响葡聚糖酶水解得率的主要因素，而木质素和半纤维素的脱除对其酶解效果影响较大。随着预处理强度的增加，纤维素含量增加，半纤维素和木质素含量减少，葡聚糖酶解得率和这两者的脱除率呈较强的线性关系；当AlCl3的用量从0增加到1.32%，纤维的切断逐渐增多，团聚现象显著增强，纤维比表面积增大，纤维素与酶的结合位点增多，毛竹酶水解得率显著增加。