高粱淀粉三种提取方法的比较及其理化性质分析

高菲 ，李欣 ，刘紫薇 ，李志江 ，2，张东杰 ，2，张洪微

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心）

高粱是世界上种植面积仅次于小麦、玉米、水稻、大麦的第五大谷类作物[1]，已成为我国重要的杂粮作物之一[2-4]。高粱营养丰富，尤其富含淀粉，其含量最高可达75%[5-6]，因此高粱不失为一种优良的淀粉生产原料。

目前，常见的淀粉提取方法有碱法[7]、表面活性剂法[8]、超声波法[9]以及酶法[10]等，其中碱法工艺比较成熟，是常用的大规模工业化生产方式[11]。这些方法也被应用于高粱淀粉的提取研究中，早在1998 年，邹剑秋等[12]采用湿磨法分离出了优质的高粱淀粉。随后几年对高粱淀粉的提取研究多采用湿磨法，并对其进行了深入研究，结果发现此法提取的高粱淀粉无法达到理想的色泽和纯度，而达到优质色泽与纯度时，其产率和回收率又不高[13]。近年来，超声波萃取结合碱法[14]和中性蛋白酶法[15]被应用于高粱淀粉的提取中，提高了淀粉提取率和品质，但未见有其他方法用于高粱淀粉提取研究中的报道。

高粱淀粉的理化性质受高粱品种、直/支链淀粉比等因素显著影响[16-19]。田晓红等[20]对我国高粱主产区的20 种高粱淀粉的微观结构、物理特性、糊化回生特性及热特性进行比较研究，发现不同品种高粱淀粉之间差异较大。陆勇[7]对5 种高粱淀粉的理化性质进行研究，结果表明不同高粱淀粉的冻融稳定性、黏度和透明度是有差异的。沈舒民[21]对17 种高粱淀粉的结构、理化和功能特性进行了全面系统的测定与分析，结果也表明各品种之间在理化性质上存在显著差异。因此为将特定品种的高粱淀粉应用于食品加工生产中，需对此高粱淀粉的理化性质进行深入研究。

龙杂13 号高粱主要种植于黑龙江省，较其他白高梁品种相比，粗淀粉含量较高为75.35%，且富含0.24%赖氨酸，具有耐密植以及抗倒伏等优点。因此，以龙杂13 号高粱为原料，分别采用碱法、中性蛋白酶法和超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉，确定最优的提取条件；测定分析高粱淀粉的理化性质，为高粱淀粉的生产和在食品中的应用提供理论依据，为高粱的深加工提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

高粱：大庆地产，龙杂13 号；中性蛋白酶（活力84 536 U·g-1菌种：枯草芽孢杆菌）：北京奥博星生物技术有限责任公司；α-淀粉酶（酶活性≥4 000 U·g-1）：北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

pHS-3C 型精密pH 计（上海雷磁仪器厂）；FW/100 粉碎机（厦门东星机械工贸有限公司）；FA1104A分析天平（上海垒固仪器有限公司）；TD5A 离心机（长沙英泰仪器有限公司）；DGG-9140 电热恒温鼓风干燥箱（上海森信试验仪器有限公司）；SK-1 快速均匀器（江苏省金坛市金城国际试验仪器厂）；THZ-82水浴恒温振荡器（江苏省荣华仪器制造有限公司）；HS6150D 型超声仪（恒奥科技有限公司）；722S 可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；JJ-2 型组织捣碎匀浆机（金坛市荣华仪器制造有限公司）；超声波处理器（上海生析超声仪器有限公司）；RVA-4500 快速黏度分析仪（波通瑞华科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 高粱淀粉提取方法

（1）高粱粗粉的制备

将清洗干净的高粱用蒸馏水浸泡12 h，用组织捣碎匀浆机打碎后过80 目筛，取过筛后的液体3 000 r·min-1离心 10 min，弃去上清液，沉淀刮去上层杂质后40 ℃烘干得高粱粗粉。

（2）碱法提取高粱淀粉

取一定量的高粱粗粉，加入一定浓度的NaOH溶液浸泡，在恒温水浴振荡器中反应一定的时间。将混合液离心，弃去上清液，将沉淀过滤，将滤液置于烧杯中，加盐酸至中性，再离心3 次弃去上清液，将沉淀取出置，于40 ℃烘箱中干燥24 h 进行烘干，得到高粱淀粉。

（3）中性蛋白酶法提取高粱淀粉

称取一定量的高粱粗粉置于烧杯中，按单因素试验设计加入一定量pH 值磷酸缓冲液后，再加入中性蛋白酶酶解一定时间。反应完成后将酶解液在3 000 r·min-1下离心 10 min，沉淀置于 80 目的尼龙纱布上用蒸馏水冲洗，弃去滤渣，滤液再次3 000 r·min-1离心10 min，得沉淀，刮去上层灰色留中间白色淀粉，再次用蒸馏水清洗、离心反复2 次，沉淀在40 ℃的干燥箱内干燥24 h，最终得白色高粱淀粉。

（4）超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉

将10 g 高粱粗粉置于碘量瓶中，加入固液比为1∶2（g∶mL）的中性蛋白酶和缓冲溶液混匀后放入 45 ℃的水浴恒温振荡器中酶解2 h。将酶解液再进行超声处理（或先超声处理再进行酶解），然后3 000 r·min-1离心10 min 得沉淀，沉淀刮去表层杂质，再次用蒸馏水清洗、离心反复2 次，沉淀在40 ℃的干燥箱内干燥24 h，最终得白色高粱淀粉。

1.2.2 单因素试验设计

（1）碱法提取高粱淀粉单因素试验设计

设计NaOH 浓度（质量浓度）、反应温度、反应时间和料液比4 个因素进行单因素试验，单因素试验设计见表1。

表1 单因素试验设计表Table 1 Single-factor experimental design conditions

（2）中性蛋白酶法提取高粱淀粉单因素试验设计

高粱中蛋白质常与淀粉分子聚合在一起，因此为提高淀粉的提取率可通过分解高粱淀粉分子上的蛋白质而实现。通过课题组预实验，得出单因素试验范围见表2。

表2 单因素实验设计表Table 2 The single factor test

（3）超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉单因素试验设计

通过超声波的空穴效应及振动，打开蛋白质与淀粉分子之间的弱键，促进蛋白质等分子从淀粉分子上解离，进而提高淀粉的得率和纯度。超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉的单因素试验设计见表3。

表3 单因素试验设计表Table 3 Single-factor experimental design test

1.2.3 正交试验设计

分别根据3 种提取方法的单因素试验结果设计正交试验，根据结果获得最佳提取的条件。

1.2.4 理化指标测定方法

（1）淀粉含量的测定及淀粉得率的计算

淀粉的含量通过采用GB 5009.9-2016 中标注的酶水解法进行测定并计算[22]。

高粱淀粉得率的计算：

式中：M淀粉：提取的高粱粗淀粉质量/g；M高粱粉：原料高粱粉质量/g。

（2）冻融稳定性的测定

冻融稳定性的测定参照文献［23-24］，将淀粉样品加水配制成6.0%的悬浮液。在水浴振荡30 min 后，取出冷却至室温，将淀粉糊样品至塑料管中并放置到冰箱中冷冻约24 h，取出放置室温解冻，在3 000 r·min-1的条件下离心20 min，弃上清液，留下沉淀物质并称重，反复进行3 次试验，取其平均值作为样品淀粉的析水率。计算公式如公式（2）所示。

式中：M 为离心前淀粉凝胶的质量/g；m 为沉淀物的质量/g。

（3）溶解度和膨胀度的测定

高粱淀粉溶解度及膨胀度的测定参照文献［25］，准确称取5 份50 mg 的样品淀粉于烧杯中，分别加入5 mL 的蒸馏水并用玻璃棒充分搅拌。在50 ℃下加热搅拌30 min，进行冷却，以3 000 r·min-1离心20 min，将上清液于105 ℃的条件下干燥至恒重，即得可溶质称重为A，下层沉淀物收集并称重为P。溶解度计算公式见公式（3）；膨胀度计算公式见公式（4）。

式中：A 为水溶淀粉的质量/g；P 为膨胀淀粉的质量/g；W 为淀粉样品的含量/g；S 为溶解度。

（4）透光率的测定

透光率的测定参照文献［26］：将淀粉样品加水配制成1%淀粉悬浮液，水浴加热约30 min，待其充分糊化后取出，使其快速冷却至25 ℃。放置在分光光度计中在650 nm 波长处测定淀粉悬浮液的透光率。并采用纯水重复试验作为对照实验。

（5）黏度的测定

在分析天平中分别准确称取高粱淀粉2 g 置于快速黏度仪铝盒中，加入25 mL 蒸馏水并用玻璃棒充分搅拌后进行测定：样品升温，50 ℃运行1 min，继续升温至95 ℃维持5 min，接着冷却至50 ℃维持2 min，得出样品糊化曲线，记录成糊温度、峰值黏度、谷值黏度等参数。

1.3 数据分析

采用SPSS 软件和Excel 2010 进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 碱法提取高粱淀粉试验结果与分析

2.1.1 单因素试验结果与分析

各因素对高粱淀粉得率的影响见图1。由图1 可知，随着各因素的变化高粱淀粉得率均呈先升后降趋势。适宜浓度的NaOH 溶液有利于高粱淀粉的溶出，但过高的浓度会促使淀粉糊化，反而不利于淀粉与蛋白质的分离；升高料液比使碱液与高粱粉充分接触更有利于碱液作用，但料液比过高会使反应物浓度下降，反应速度趋缓；过高的反应温度和过长的反应时间也会明显降低淀粉得率，这与高温下淀粉糊化及碱液开始破坏淀粉分子结构有关。因此根据单因素试验结果，选NaOH 浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%，料液比 1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL），反应温度 30、35、40 ℃，反应时间 1.5、2.0、2.5 h 进行正交试验。

图1 碱法不同因素对高粱淀粉得率的影响Fig.1 Effect of alkali method on the extraction rate of sorghum starch

2.1.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果设计正交试验，因素水平见表4，正交试验结果见表5。

表4 正交试验因素水平表Table 4 Level of factors for orthogonal test

表5 正交试验结果表L9（34）Table 5 Orthogonal test results table L9（34）

由表5 可知，碱法对高粱淀粉提取实验下，NaOH 浓度、反应温度、反应时间、料液比对高粱淀粉的得率均有影响，因D＞C＞A＞B，得到较优的工艺条件为 A2B2C3D3，NaOH 浓度0.4%、反应温度为 35 ℃、反应时间为 2 h、料液比为 1∶15（g∶mL）。经验证试验，高粱淀粉的粗淀粉得率为81.54%，高粱淀粉含量为82.39%，淀粉呈浅红色粉末状。

2.2 中性蛋白酶法提取高粱淀粉的试验结果与分析

2.2.1 单因素试验结果与分析

中性蛋白酶法不同因素对高粱淀粉得率的影响见图2。由图2 可知，酶添加量、酶解温度、酶解时间、料液比对高粱淀粉得率影响明显。在酶添加量达700 U·g-1时，高粱淀粉得率明显提高，之后酶添加量的增大淀粉得率无明显增加，说明酶与底物的相互作用基本饱和；而当酶解温度40 ℃、酶解pH 7.0、料液比 1∶3（g∶mL）时，淀粉得率达最大值，因此选取酶添加量 500、700、900 U·g-1，酶解温度 35、40、45 ℃，酶解 pH 6.5、7.0、7.5，料液比 1∶2（g∶mL）、1∶3（g∶mL）、1∶4（g∶mL）设计正交试验。

图2 中性蛋白酶法不同因素对高粱淀粉得率的影响Fig.2 Effect of different factors of neutral protein enzymatic method on starch yield of sorghum

2.2.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果设计四因素三水平的正交试验，因素水平设计表见表6，正交试验结果表见表7。

(2) 对于该工程案例水道系统花岗岩断层蚀变带洞段围岩同时存在断层塌洞、松散堆积体与节理裂隙，既存在灌浆量大扩散范围广难以控制，又存在断层泥化物质和高岭土化蚀变带浆液又难以浸入，及高压下结构面易劈裂等问题，采取系统深孔水泥高压灌浆，再系统浅孔复合灌浆的综合处理措施效果明显。

表6 正交试验因素水平表Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment

表7 正交试验结果表L9（34）Table 7 Orthogonal test results table L9（34）

由表7 可知，中性蛋白酶添加量、料液比、酶解pH、酶解温度对高粱淀粉得率均有影响。因为A＞B＞D＞C，最佳提取条件为A2B1C3D3，即中性蛋白酶添加量 700 U·g-1、料液比 1∶2（g∶mL）、酶解温度 45 ℃、酶解pH 7.5。经验证试验，高粱淀粉的粗淀粉得率为80.70%，淀粉含量为81.58%，淀粉为浅褐色粉末状。

2.3 超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉的结果与分析

2.3.1 单因素试验结果与分析

超声波辅助中性蛋白酶法不同因素对高粱淀粉得率的影响见图3。根据超声顺序试验结果发现（试验条件：超声时间6 min，超声功率135W），先酶解后超声的淀粉得率高于先超声后酶解，因此在超声时间和超声功率的单因素试验中均选择先酶解而后超声的超声顺序。超声时间为2 min 时，高粱淀粉得率较高，但经测定此时淀粉纯度较低，可能是超声时间过短，还无法打开淀粉与蛋白质的聚集体，致使淀粉中残留较多杂质。 超声功率对高粱淀粉得率影响明显，超声功率为225 W 时淀粉得率较高。

图3 超声波辅助中性蛋白酶法不同因素对高粱粗淀粉得率的影响Fig.3 Effect of different factors of ultrasonic assisted neutral protease on crude starch yield of sorghum

2.3.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，选择先酶解后超声的试验顺序，以超声时间和超声功率为因素设计正交试验，因素水平见表8，正交试验结果见表9。

表8 正交试验因素水平表Table 8 Factors and levels of orthogonal experiment

表9 正交试验结果表Table 9 Orthogonal experimental table

由表9 可知，超声顺序、超声功率、超声时间对高粱淀粉提取得率均有影响，因为B＞A，经极差分析最佳提取条件为A1B2，即先酶解后超声，超声功率为135 W，超声时间为6 min。经验证试验，高粱淀粉得率为83.27%，淀粉含量为94.08%，淀粉呈白色粉末状。

根据以上试验结果分析3 种提取方法发现，碱法的得率虽高于中性蛋白酶法，但其淀粉含量低于酶法，说明碱法对蛋白质的去除效果不如酶法。超声波辅助中性蛋白酶法的淀粉得率较高，且淀粉含量可达94.08%，淀粉呈白色，因此，从提取效果上看超声波辅助中性蛋白酶法优于另外两种方法。

2.4 高粱淀粉的理化性质测定结果与分析

采用超声波辅助中性蛋白酶法提取高粱淀粉，分别测定了高粱淀粉的溶解度、膨胀度、析水率和透光率，同时对高粱淀粉糊化性质进行测定，测定结果见表10。

表10 高粱淀粉的理化性质测定结果Table 10 Physicochemical properties of sorghum starch

高粱淀粉的理化性质受高粱品种、淀粉制备方法、淀粉颗粒形态等多种因素影响，其不同品种之间的差异较大[18]。淀粉的溶解度和膨胀度大小表明了淀粉分子与水分子之间相互作用的程度[27]，其受温度影响明显，高粱淀粉同样符合这一规律，测定温度为50 ℃时，提取的高粱淀粉溶解度为3.90%、膨胀度为3.52%，明显高于田晓红测定的20 种高粱淀粉[20]，说明龙杂13 号高粱淀粉更易于与水分子相互作用，有利于高粱淀粉的糊化加工。同时淀粉颗粒与水相互作用，在水中均匀分散，其透明度则较大，赋予食品优良的感观品质。经测定，龙杂13 号高粱淀粉透光率为52.16%，低于田晓红[20]测定的20 种高粱淀粉的平均透光率（73.08%），但高于 7 种酿酒[18，28]用高粱淀粉。析水率是淀粉冻融稳定性的评价指标，析水率越低说明其冻融稳定性越好。龙杂13 号高粱淀粉经24 h 冷冻，一次冻融循环测得析水率为17.71%，低于马铃薯淀粉、玉米淀粉和绿豆淀粉等[29]常用淀粉，因此其冻融稳定性较好，更适于冷冻食品加工。

淀粉的糊化特性是影响淀粉加工性能的主要因素，成糊温度、黏度变化及回生值的高低影响淀粉类食品加工特性和产品的品质。一般成糊温度越低，产品越易于糊化，龙杂13 号高粱淀粉的成糊温度为76.4 ℃，段冰等人测定的10 种高粱淀粉的成糊温度在 69.1～83.1 ℃之间[30]，田晓红测定的 20 种高粱淀粉的糊化温度则在62.63~64.40 ℃之间，相比较，龙杂13 号的成糊温度较高。峰值黏度反映淀粉在黏度达最高时淀粉颗粒的溶胀程度，谷值黏度也是最低黏度，峰值黏度与谷值黏度之差越大，说明淀粉颗粒在糊化过程中稳定性越差，而试验测得样品的此差值较小，其最终黏度也不高，回生值同样处于较低水平，由此说明，龙杂13 号高粱淀粉具有较好的糊化稳定性，且不易老化。

3 结论

碱法、中性蛋白酶法及超声波辅助中性蛋白酶法都可用于高粱淀粉的提取，但所获得的淀粉得率和淀粉含量不同，其中超声波辅助中性蛋白酶法提取的淀粉得率和含量都优于另外两种方法，所得高粱淀粉品质较好。

经理化性质测定发现，采用超声波辅助中性蛋白酶法提取的龙杂13 号高粱淀粉具有较高的溶解度、膨胀度与透明度，说明此品种高粱淀粉较易于与水分子相互作用，其在水中分散性较好；析水率较低，因此具有较好的冻融稳定性。经糊化性质的测定分析，龙杂13 号高粱淀粉具有较高糊化温度，但其峰值黏度、谷值黏度、最终黏度及回生值相对较低，具有较好的糊化稳定性，不易老化。利用以上性质特点，龙杂13 号高粱淀粉可根据食品生产的实际需求，用于焙烤类、冷冻类等食品的加工生产中。