胶体金试纸条法快速检测纺织品中总铅和总镉含量

徐建云，黄启英，刘 娟

(江苏省纺织产品质量监督检验研究院，江苏 南京 210007)

近年来，纺织品的绿色安全越来越受到消费者的关注，纺织品中铅(Pb)、镉(Cd)元素超标案例不断被报道。纺织品与消费者密切接触，其表面残留的重金属元素Pb、Cd迁移会损害人体健康。纺织品是人体摄入Pb、Cd元素的主要来源之一，检测纺织品中的Pb、Cd含量是控制人体Pb、Cd摄入量的重要预防措施。目前国内普遍依据GB/T 30157—2013《纺织品 总铅和总镉含量的测定》对纺织品进行测试[1]，主要采用电感耦合等离子体发射光谱仪进行测试，该方法与石墨炉-火焰原子吸收分光光度法为经典的两种重金属检测方法，除此之外，还有电感藕合等离子体质谱法、X射线荧光光谱法、基于显色剂的分光光度法、电化学分析方法、高效液相色谱法等[2-5]。目前纺织品中重金属Pb、Cd元素的检测方法存在检测过程中依赖大型仪器设备、设备昂贵、方法耗时、仪器使用和维护成本高、检测人员需具备一定的专业知识等问题，导致上述传统检测方法很难在实验室推广，更不适合于现场快速检测[7-9]。因此，建立一种操作简便、现场快速检测纺织品中有害重金属元素的方法是当今行业内的迫切需求[10-11]。

胶体金试纸条法是一种基于金纳米粒子(AuNPs)标记的抗原抗体反应的重金属Pb、Cd元素检测技术，该类试纸条具有无背景干扰、肉眼易识别、灵敏度高、操作简单、携带方便、试剂用量少、无需任何仪器设备、成本低等优点，有望真正实现现场快速检测，是目前常用的重金属Pb、Cd元素快速检测方法之一。作者以Pb、Cd单克隆抗体为基础，研制出一种用于现场快速检测纺织品中总Pb、总Cd含量的胶体金试纸条，并采用该胶体金试纸条对纺织品中总Pb、总Cd含量进行筛检。

1 实验

1.1 试样与试剂

纯棉针织面料：江苏常熟市富康达针纺织品有限公司产。

Pb、Cd单克隆抗体：实验室自制；羊抗小鼠(IgG)：长春鼎国生物技术有限公司产；氯金酸(HAuCl4)、牛血清蛋白(BSA)：美国Sigma公司产；柠檬酸三钠、氯化钠、过氧化氢、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、硝酸、磷酸氢二钠二水化合物、磷酸二氢钾：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产；玻璃纤维素膜：芬兰Ahlstrom公司产；硝酸纤维素膜：德国Sartorius公司产；PVC板、试纸卡、吸水纸：上海杰一生物科技有限公司产；Pb、Cd单元素标准溶液：浓度为100 μg/mL，中国计量科学研究院产；氩气：纯度大于99.99%，南京红健气体有限公司产；超纯水：自制。

1.2 仪器

Avio200电感耦合等离子体发射光谱仪：美国铂金埃尔默公司制；Cary 60紫外可见分光光度计：美国安捷伦公司制；高速离心机：德国Sigma公司制；BP221S 型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司制；METTLER TOLEDO Seven Compact pH计：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司制；恒温磁力搅拌器、SHZ-88A 恒温水浴振荡器：江苏太仓实验设备厂制；超纯水制备装置：美国Millipore公司制；CEM MARS6微波消解仪：美国CEM公司制；HM3030划膜喷金仪：上海金标生物科技有限公司制。

1.3 胶体金探针的制备

1.3.1 AuNPs的制备与表征

参照文献[12]，通过热还原HAuCl4获得柠檬酸钠保护的AuNPs。在快速搅拌的情况下，将15 mL 38.8 mmol/L柠檬酸钠溶液立即加入到煮沸的150 mL 1.0 mmol/L HAuCl4溶液中，并保持沸腾15 min；连续搅拌溶液冷却至室温，然后通过0.2 μm滤膜过滤，得到AuNPs。

1.3.2 Pb及Cd单克隆抗体标记胶体金探针的制备与纯化

胶体金探针是分别用Pb、Cd单克隆抗体修饰直径为15 nm的AuNPs来制备。通过滴加碳酸钾溶液调节AuNPs分散液的pH值为8.5，然后取1 mL AuNPs分散液分别与等量Pb、Cd单克隆抗体 (5 μL, 100 nmol/L)混合，逐滴加入抗体溶液，搅拌10 min，静置10 min，再向管内加入100 μL质量分数为10%的PEG溶液，搅拌20 min，混匀静置老化40 h；在转速10 000 r/min下离心30 min，以去除过量的试剂；通过50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(PBS)对沉淀物连续3次离心-分散进行洗涤；最终分散在含有0.1 g/L PEG 的50 mmol/L PBS溶液中(pH值为7.5)，获得Pb及Cd单克隆抗体标记胶体金探针，备用。

1.4 胶体金试纸条的制备

1.4.1 试样垫及结合垫的制备

分别取玻璃纤维素膜将其切割成2.0 cm×5.0 cm浸泡于pH值为7.5的PBS溶液中4 ℃过夜，37 ℃风干制成试样垫、结合垫，于4 ℃密封保存备用。

1.4.2 硝酸纤维素膜的包被加工

取硝酸纤维素膜1条，并切割成2.5 cm×5.0 cm，分别将1.0 mg/mL完全检测抗原、羊抗小鼠IgG加入洗净的划膜喷金仪喷头，固定检测线和质控线位置，进行喷膜，待硝酸纤维素膜风干，4 ℃密封保存备用。

1.4.3 胶体金结合垫的制备

将制备好的Pb及Cd单克隆抗体标记胶体金探针分别包被于玻璃纤维膜上，风干，得到胶体金结合垫，4 ℃密封保存备用。

1.4.4 吸收垫的制备

取吸水纸将其切割成2.0 cm×5.0 cm，制备吸收垫，4 ℃密封保存备用。

1.4.5 胶体金试纸条的组装

胶体金试纸条的组装过程见图1。在PVC底板上依次将试样垫、胶体金结合垫、包被有抗原和IgG的测试线和控制线的硝酸纤维素膜及吸收垫进行组装，其中，硝酸纤维素膜置于底板中部，结合垫一边缘搭于硝酸纤维素膜靠近检测线一端，另一端稍重叠于PVC板上，试样垫一端继续叠加在该端胶体金结合垫，试样垫另一端贴合于PVC板上，则两端分别叠加于硝酸纤维素膜、PVC底板上，吸水垫始端叠加于硝酸纤维素膜另一端，吸水垫末端与底板末端对齐，在保护膜上印有样液流动箭头指向标记，该保护膜覆盖在试样垫上，最终将组装好的胶体金试纸条切割成4 mm 宽的试纸条，4 ℃密封保存备用。

图1 胶体金试纸条组装示意Fig.1 Schematic diagram of colloidal gold test strip1—试样垫；2—连接垫/胶体金垫；3—质控线；4—吸收垫；5—背衬(底板)；6—检测线；7—硝酸纤维素膜

1.5 样液的制备

1.5.1 试样前处理

将纯棉针织面料试样剪碎至5 mm×5 mm以下，称取 0.20 g置于聚四氟乙烯消解容器中；加入7 mL浓硝酸、3 mL双氧水，待试样和浓硝酸在室温下反应完全后，将消解容器密封并放置到微波消解仪中，15 min内升温至(180±5) ℃，并在(180±5) ℃ 保持 6 min，取出消解罐，打开前应先在通风柜中将微波消解罐静置并冷却到室温或冷却30 min；取出聚四氟乙烯消解罐在加热板上于100 ℃加热30 min赶酸，用一级水分 3 次淋洗，将消解溶液转移至25 mL容量瓶中，用一级水定容至刻度，摇匀，获得样液；用质量分数1%的氢氧化钠溶液调节样液pH值为5.5，经无机滤膜过滤后，用于测定纺织品中总Pb、总Cd含量。

1.5.2 0.02 mol/L EDTA溶液的配制

在天平上准确称取3.80 g EDTA，溶于100 mL去离子水中，微热溶解后，转移到500 mL容量瓶中，再加入去离子水定容摇匀。

1.5.3 待测液的制备

将含有不同质量浓度的Cd、Pb标准溶液、样液分别与过量的EDTA螯合溶液(体积比1:1，EDTA过量)混合，制备Pb-ITCBE、Cd-ITCBE标准待测液和试样待测液。

1.6 试纸条的应用及方法评价

1.6.1 胶体金试纸条的应用

将待测液滴于试样垫中，待测液向吸收垫方向移动，到达结合垫时，会与胶体金复合物结合，待测液中Pb、Cd离子越多，到达检测线时，与检测线上的完全检测抗原结合的金标抗体越少，检测线上截留的金标抗体越少，显色越浅，反之，待测离子越少，检测线红颜色越深；待测液到达质控线时，无论样液里是否含有待测Pb、Cd离子，胶体金复合物均会与质控线上的IgG结合，质控线显红色，如果质控线不显色，则测试结果为无效。当测定有效进行时，控制线(C线)一直会显示红色；若不显色，则测试无效。

当待测液中Pb/Cd-ITCBE质量浓度小于最低检出限浓度时，胶体金结合垫中的单克隆抗体胶体金复合物与T线上Cd完全检测抗原结合，检测线显红。

1.6.2 方法检出限的测定

分别将100 μg/mL Pb或Cd的标准溶液，用PBS配制成Cd浓度为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb浓度为5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的系列标准溶液。分别取1 mL与EDTA溶液混合反应(体积比1:1，EDTA过量)，最终制备系列标准样液。取上述100 μL样液分别滴加至胶体金试纸条的试样垫上，等待3～5 min后，观察检测线、控制线显色情况，记录目测检测线有显色时对应标准样液的浓度。以确定试纸条对待测重金属元素的检出限，进一步推算出试纸条对纺织品中总Cd、总Pb含量的检出限。

1.6.3 准确性评价

选择砷(As)、锑(Sb)、镍(Ni)、钴(Co)、铬(Cr)、铜(Cu)6种金属离子，分别配成浓度为30 μg/L的水溶液，用试纸条进行检测。

1.6.4 重现性及稳定性评价

将试纸条放入密封盒中，加入干燥剂，分别于4 ℃、室温和37 ℃保存1，5，7，8，10，15，30，50，60，70，80 d。取出试纸条，分别滴加浓度为50.0 μg/L的Cd或Pb溶液，考察试纸条在不同存储温度及不同存储时间下的显色反应。

2 结果和讨论

2.1 AuNPs的表征

采用紫外分光光度计在波长(λ)400～600 nm扫描胶体金溶液，得到其吸光度(Abs)。从图2可以看出，胶体金溶液的最大吸收峰在 523 nm处，无杂峰，且峰宽较小，表明制备的AuNPs颗粒分布均匀。

图2 胶体金溶液的紫外吸收光谱Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of colloidal gold solution

胶体金溶液的透射电镜扫描结果见图3。

图3 胶体金溶液的透射电镜照片Fig.3 Transmission electron microscope photograph of colloidal gold solution

从图3可以看出，AuNPs颗粒大小均一，经计算，AuNPs直径在15 nm左右，适合单克隆抗体标记，可在试纸条检测线上产生可目测的强烈信号。AuNPs颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。AuNPs对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到AuNPs颗粒表面，无共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。

2.2 抗体标记条件优化

用50 mmol/L 的磷酸氢二钠溶液调节胶体金溶液的pH值分别至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0；分别取1 mL胶体金溶液，并加入50 μL标记抗体，混匀，静止10 min，再分别加入50 μL 质量分数20%的NaCl溶液，混匀后静止3 h，测定单抗修饰胶体金溶液在吸收波长570 nm处的Abs。从图4可以看出，在pH值为7.5及8.5时，胶体金溶液为透明红色液体，Abs最大，之后出现显著下降，在其他pH值时，AuNPs颗粒出现团聚变蓝现象，说明在pH值为7.5及8.5时，胶体金分别与Pb及Cd单抗的吸附较好。在pH值接近于蛋白质等电点或略偏碱性时，蛋白质所处溶解状态最适合偶联，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

图4 单抗修饰胶体金溶液的Abs随pH值的变化Fig.4 Change of Abs with pH value of monoclonal antibody modified colloidal gold solution ●—Pb单抗；■—Cd单抗

2.3 Pb及Cd单克隆抗体用量

分别取10份pH值为7.5及8.5的1 mL胶体金溶液，分别加入20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 μL的 Pb及Cd单克隆抗体进行标记，在振荡器上振荡混匀10 min，静置10 min，再分别加入50 μL质量分数20%的NaCl溶液，混匀10 min，测定吸收波长570 nm处单抗修饰的胶体金溶液的Abs。从图5可以看出：随着Pb及Cd单克隆抗体加入量增大，溶液的Abs先增大后降低；在Pb及Cd单克隆抗体加入量分别为50 μL及45 μL时，单抗修饰胶体金溶液的Abs最大；继续添加Pb及Cd单克隆抗体，胶体金溶液的Abs下降，胶体金溶液保持稳定红色。因此， Pb、Cd抗体较佳用量分别为50 μL及45 μL。

图5 胶体金溶液的Abs随Pb及Cd单克隆抗体用量的变化Fig.5 Change of Abs of colloidal gold solution with amounts of Pb and Cd monoclonal antibodies ■—Pb单抗；●—Cd单抗

2.4 方法评价

2.4.1 方法检出限

从表1、表2可知：分别用Cd质量浓度为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb质量浓度为5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的标准溶液与EDTA进行螯合，并用Pb及Cd试纸条检测，等待3～5 min，部分试纸条检测线、质控线显红色，Pb及Cd标准溶液质量浓度为分别为40 μg/L及5.0 μg/L时，试纸条检测线目测浅红色，质控线显红色，判为假阴性；低于此浓度，C 线显色，T 线目测显红色，初步确定为阴性；分别用高于40 μg/L及5.0 μg/L的Pb及Cd标准溶液进行试纸条检测时，T线不显色，C线为红色条带，判为阳性。因此，分别选择40 μg/L及5.0 μg/L为Pb及Cd试纸条的检出限，折算到纺织品试样中，Pb及Cd试纸条对Pb及Cd的检出限分别为5.0 mg/kg及0.625 mg/kg。国家强制性标准GB 31701—2015《婴幼儿及儿童纺织产品安全技术规范》规定纺织品中总Cd含量不超过100 mg/kg、总Pb含量不超过90 mg/kg的限量值要求，利用制备的Pb及Cd试纸条测定纺织品中总Pb、总Cd含量，可以满足日常检测初筛需求。

表1 Pb试纸条对不同浓度的Pb的灵敏度分析Tab.1 Sensitivity analysis of Pb test strip to Pb of different concentrations

表2 Cd试纸条对不同浓度的Cd的灵敏度分析Tab.2 Sensitivity analysis of Cd test strip to Cd of different concentrations

2.4.2 方法准确性

使用Pb及Cd试纸条检测其他金属离子，进行选择性实验，验证试纸条的准确性，结果见表3。

表3 试纸条对Pb离子及Cd离子的选择性Tab.3 Selectivity of Pb and Cd ions by strips

从表3可知：采用Pb试纸条分别对含As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu、Pb离子的溶液进行测试，滴加含有As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu离子的溶液时，Pb试纸条呈阴性，而滴加含有Pb离子的溶液时，Pb试纸条呈阳性，As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu离子对Pb试纸条测试不会造成干扰；采用Cd试纸条测试，滴加含有As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu离子的溶液时，Cd试纸条呈阴性，而滴加含有Cd离子的溶液时，Cd试纸条呈阳性，As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu离子对Cd试纸条测试不会造成干扰。因此，该方法用于测定纺织品中总Pb、总Cd含量时都无假阴性现象，确保了该方法的准确性。

2.4.3 试纸条稳定性

试纸条在不同存储温度及不同存储时间下的显色反应结果表明，结合垫上的Pb及Cd金标记抗体在4 ℃下分别保存70 d及50 d内，结合垫上的金标探针仍可以完全释放，没有出现拖尾及条带中空现象，检测线和控制线显色情况和保存前一致；结合垫上的Pb及Cd金标记抗体在室温或37 ℃条件下仅放置10 d，试纸条的活性有所下降。由此可见，本方法的Pb及Cd试纸条具有较好的稳定性。

3 结论

a.建立了一种基于Pb、Cd单克隆抗体的胶体金试纸条方法，可用于快速检测纺织品中总Pb、总Cd含量。

b.Pb及Cd试纸条对纺织品中总Pb、总Cd含量的检出限分别达到5.0 mg/kg 和0.625 mg/kg，仅需3～5 min 即可便捷实现试样中总Pb、总Cd含量的目测初筛判定；其灵敏度和稳定性均能满足实际试样的测试要求。

c.该方法操作方便、准确度高，对Pb、Cd离子的检测具有良好的选择性，适用于纺织品现场快速、批量筛检。