针刀对中晚期膝骨关节炎兔软骨下骨重塑的影响*

刘 聪 郭 妍 秦露雪 王军美 尹孟庭 郭长青△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医医院，北京 100010）

膝骨关节炎（KOA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨硬化伴骨赘形成及滑膜增生为主要病理改变，以关节疼痛、僵硬和功能障碍为主要临床表现的慢性退行性全关节病变[1]，是导致老龄化人口疼痛和残疾的主要原因，患者生活质量受到严重影响，为家庭和社会带来沉重的经济负担。

在导致KOA的众多原因中，关节软骨的退化或丧失一直以来被认为是主要原因，但学者Radin首次提出，在软骨退变的开始和进展过程中软骨下骨起着重要作用，越来越多证据证明了这一观点，甚至有学者认为软骨下骨异常重塑可能是KOA发病的始动因素[2-3]。虽然迄今为止仍未能明确直接导致KOA的原因，但软骨下骨作为一个新的研究热点，其重要性已得到公认。在膝关节中，软骨下骨为软骨提供机械支撑，并与其他关节组织共同维护关节软骨的稳态和完整性[4]，但在异常机械应力的作用下，软骨下骨发生异常骨重塑，主要表现为KOA早期骨吸收，中晚期骨形成[5]，这些变化均导致软骨下骨刚度发生改变，其合理分配负荷的能力降低，导致上覆关节软骨的应力增加，进而诱发软骨退变并进一步导致KOA。

近年来针刀疗法在治疗KOA中得到了广泛应用，并取得了较好的缓解症状和改善关节功能的效果。本团队前期研究也证明了针刀能够恢复关节内良性应力刺激、修复软骨[6-8]，但对软骨下骨异常重塑是否具有调控作用尚不明确。本研究通过对软骨下骨Micro-CT扫描及三维重建，探究针刀干预对软骨下骨重塑的调控作用，揭示针刀治疗KOA的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级6月龄健康雄性新西兰兔30只，由北京科宇动物养殖中心提供（许可证号：SCXK京2018-0010），体质量2.0～2.5 kg，本实验在中国中医科学院中药研究所完成，保证所有实验动物单笼饲养，控制室温20～24℃，相对湿度40%～60%，自由获取食物和水，定期紫外线消毒。

1.2 试剂与仪器

树脂绷带（规格：15 cm×180 cm，珠海丽珠医用生物材料有限公司）；高分子绷带（规格7.5 cm×360 cm，苏州可耐特医疗科技有限公司）；HZ系列一次性针刀（规格0.3 mm×30 mm，北京卓越华友医疗器械有限公司）；一次性无菌针灸针（规格0.2 mm×13 mm，环球牌，苏州针灸用品有限公司）；二磷酸盐（利塞磷酸钠，Risedronate sodium，美国LKT Laboratories公司）；韩式穴位神经刺激仪（仪器型号LH202H，北京华为产业开发公司）；活体动物体内成像系统Quantum FX Micro-CT成像系统（仪器型号PE Quantum FX，美国PerkinElmer公司）。

1.3 分组与造模

采用随机数字表法将30只雄性新西兰兔随机分为空白组、模型组、针刀组、电针组和骨代谢调节剂组，每组6只。制备KOA模型采用改良Videman法左后肢伸直位固定制动。由两名操作者共同完成，一人将兔仰卧位固定在试验台上，另一人进行造模操作。操作者一手牵拉兔左后肢，使膝关节完全伸直，将树脂绷带于（75±10）℃热水中浸泡软化，垫脱脂棉于树脂绷带内以减缓压力，再将兔左后肢用树脂绷带从腹股沟处至足趾固定，保持膝关节呈180°伸直位，踝关节呈60°背屈，外层用高分子材料进行加固，最外层用防啃咬绷带包裹。保持末端足趾露出，以便观察血供情况及有无肿胀。除空白组外，其余4组均按上述方法造模，固定制动9周。造模结束后，用随机数字表法每组选取1只兔，处死后取膝关节软骨下骨进行病理观察，判断其病理变化是否符合要求，若显示造模成功即可拆除所有动物的制动材料。

1.4 干预方法

空白组不做任何处理，常规饲养，每天正常抓取、固定。模型组造模成功后常规饲养，每天正常抓取、固定。针刀组：拆除制动材料1周后，给予针刀干预治疗。将KOA兔固定后，在左后肢膝关节周围用龙胆紫定位，常规备皮、消毒，按照针刀四步进针规程操作，松解完成后取出针刀，用棉球按压片刻止血。进针点及具体针刀操作如下。1）股内、外侧肌腱止点：针刀刀刃平行肌腱、刀体与皮肤平面垂直进针，松解股内、外侧肌腱延续处。2）股直肌肌腱止点：进针方向同上，松解髌骨上缘即股直肌肌腱移行处。3）股二头肌肌腱止点：进针方向同上，松解股二头肌肌腱移行处。4）鹅足囊：进针方向同上，松解鹅足囊，即缝匠肌、股薄肌及半腱肌的联合腱，向肌腱与骨连接方向进行松解。每周治疗1次，治疗3周。电针组：拆除制动材料1周后开始电针治疗。参照《实验动物学》定位取穴，结合动物比较学方法、比较解剖取穴法及模拟骨度取穴法，选取曲泉、委阳、内膝眼和外膝眼干预治疗。常规备皮、消毒，选定穴位后将毫针刺入约5 mm，针刺后接韩氏穴位神经刺激仪以疏密波行刺激治疗，电针分别连接曲泉与委阳，内膝眼与外膝眼，频率2/100 Hz，强度3 mA，留针15 min，隔天治疗1次，共治疗3周。骨代谢调节剂组：拆除制动材料1周后，皮下注射二磷酸盐（利塞磷酸钠，Risedronate sodium）0.01 mg/kg体质量，每天注射1次，共治疗3周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 行为学观察 分别于制动措施解除后1周与干预结束后1周，采用改良Lequesne MG[9]膝关节级别评估量表对各组兔左侧膝关节进行评估，分别从局部疼痛度、步态、关节活动度、关节肿胀度4个方面进行评分，总分越高表明膝关节功能障碍越严重。由2名人员分别进行评价后取两者平均值。

1.5.2 取材 于干预结束1周后，用3%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量耳缘静脉注射麻醉。左后肢腹股沟至踝关节范围常规备皮、消毒，在无菌条件下切取关节面上下各2 cm骨的膝关节，清除多余软组织，于-20℃环境下冷冻保存48 h后，进行Micro-CT检查。

1.5.3 影像学检测 采用Micro-CT进行软骨下骨二维观察、三维重建及定量分析软骨下骨显微结构参数变化。将兔膝关节标本置于Micro-CT检测舱内，用绷带捆绑固定以防止移位，扫描时沿标本长轴方向，扫描参数为：扫描分辨率45 μm，旋转角度210°，旋转角度增量0.5°，层间距20 μm，曝光时间2 960 ms，扫描时间18 min，对同一样品500张不同截面图片，选用1 000分割值，完成图像二值化。三维重建时选用完整的软骨下骨组织作为兴趣区域（ROI），选定ROI内骨进行三维可视化呈现。用Micview V2.1.2三维重建处理软件和ABA专用骨骼分析软件进行定量分析。测量参数有骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁数量（Tb.N）及骨小梁间隔（Tb.Sp），骨密度（BMD），分为组织骨密度（tBMD）与体积骨密度（vBMD），骨体积分数（BVF）。

1.6 统计学处理

采用SPSS21.0统计软件统计分析数据，首先检验正态性和方差齐性，若呈正态分布且方差齐则选用单因素方差分析（one-way，ANOVA），若不符合正态性检验或方差不齐则选用非参数检验法分析。样本数据以（）表示。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著差异。

2 结 果

2.1 各组兔Lequesne MG行为学评分比较

见表1。采用改良Lequesne MG膝关节评分量表评估比较各组兔膝骨关节炎级别。结果显示，与空白组相比，模型组改良Lequesne MG膝关节评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，针刀组、电针组评分明显改善，差异有统计学意义（P＜0.01），骨代谢调节剂组评分无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针组与针刀组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组兔Lequesne MG行为学评分比较（分，±s）

表1 各组兔Lequesne MG行为学评分比较（分，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别空白组模型组电针组针刀组骨代谢调节剂组n 6 6 6 6 6干预前0±0 7.00±0.89**7.33±0.82**7.33±0.82**7.17±0.98**干预后0±0 6.83±0.75**4.57±0.78△△4.57±0.78△△6.83±0.75

2.2 影像学检测

2.2.1 Micro-CT成像 Micro-CT冠状面二维图像显示，空白组软骨下骨骨小梁呈网格状均匀有序排列；模型组软骨下骨骨板增厚，骨小梁局部断裂扭曲，排列紊乱不均，部分呈融合表现，网状结构消失；骨代谢调节剂组与模型组表现相似；电针组与针刀组较模型组明显改善，软骨下骨骨小梁形状较为规则，排列较整齐有序。见图1。三维重建图可见模型组较空白组软骨下骨骨髁边缘生出大量骨赘，电针组与针刀组可见骨赘明显减少，骨代谢调节剂组与模型组差别不明显。

图1 各组膝关节软骨下骨Micro-CT冠状面二维图形

2.2.2 各组兔软骨下骨显微结构参数比较 见表2，表3。Micro-CT骨组织参数定量分析显示，与空白组相比，模型组Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明显升高；Tb.Sp明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，针刀组及电针组Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明显降低；Tb.Sp明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。针刀组与电针组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），但针刀组相较电针组Tb.Th、Tb.Sp、vBMD及tBMD的改善趋势更为明显，更接近空白组。骨代谢调节剂组对比模型组各数据差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组兔软骨下骨骨小梁厚度、间隔、数量参数比较（±s）

表2 各组兔软骨下骨骨小梁厚度、间隔、数量参数比较（±s）

组别空白组模型组电针组针刀组骨代谢调节剂组n 6 6 6 6 6 Tb.Th（mm）0.618±0.074 0.818±0.069**0.671±0.048△△0.704±0.068**△△0.774±0.062**Tb.Sp（mm）0.770±0.094 0.671±0.043**0.755±0.040△△0.718±0.036△△0.640±0.058**Tb.N（1/mm）0.688±0.052△△0.821±0.055**0.727±0.095△0.722±0.058△0.760±0.073

表3 各组兔软骨下骨密度、骨体积分数参数比较（±s）

表3 各组兔软骨下骨密度、骨体积分数参数比较（±s）

组别空白组模型组电针组针刀组骨代谢调节剂组n 6 6 6 6 6 BVF（%）76.62±4.78 94.75±3.82**81.18±7.68△△81.67±3.67△△87.28±8.47**vBMD（mg/cm3）1 808.76±59.14 2 361.48±333.46**1 977.68±187.01△△2 028.32±115.78△2 323.40±257.50**tBMD（mg/cm3）2 371.71±57.95 2 945.82±239.80**2 479.25±320.68△△2 628.21±232.50△2 754.77±218.23**

3 讨 论

本实验选用新西兰兔作为实验动物，兔易于获取和饲养，关节体积较大，其大体结构与人类关节相似，取材时操作方便，可用于实验观察的组织多[10]。目前常用的KOA模型的制备方法大致分为手术法和非手术法，非手术法中较为常见的有关节制动和关节腔注射，前期研究表明各种原因引起的膝周生物力学失衡是导致KOA的重要因素，因此关节制动法更能复刻出力学失衡环境下导致KOA的发病过程，故本实验采用改良Videman法制备动物模型。

近年来越来越多的研究表明软骨下骨在KOA发生发展中具有重要意义。在膝关节中软骨下骨位于软骨下方，由软骨下骨板和软骨下骨小梁两部分组成，具有吸收机械应力、缓冲振动和维持关节正常形态等功能。正常情况下，软骨下骨可缓冲关节内约30%的机械应力，从而避免过于集中的应力对关节软骨造成的损害[11]。软骨下骨重塑在生理状态下始终处于动态平衡，在成骨细胞和破骨细胞的共同作用下，维持软骨下骨微结构稳定，保证关节能够适应日常机械负荷[12]。但当机械应力超过关节的适应能力时，该动态平衡被打破，导致软骨下骨出现异常重塑，在KOA早期，骨吸收占主导，在中晚期，骨形成占主导。具体表现为早期破骨细胞降解活性增强，骨吸收增多，致使软骨下骨呈骨质疏松样改变。但骨体积减小后对异常应力的负荷能力下降，为维持正常的生物力学性能，中晚期时成骨细胞的成骨活性增强，骨形成明显，骨小梁由原先稀疏多孔变得逐渐致密化，软骨下骨板增厚[13-14]。上述改变导致关节内机械应力分布不均，软骨下骨吸收机械应力和缓冲震荡的能力下降，使软骨过度负荷，进而出现磨损和退变，软骨退变又反作用于软骨下骨，进一步加剧异常骨形成，加速KOA的发生发展[15]。有大量研究证实，通过改善异常骨形成，使软骨下骨向正常状态转化，对外界应力的承受能力增强，延缓软骨退变，达到缓解KOA的目的。

Micro-CT是近年来新兴的能够精确显示骨显微结构的设备，有分辨率高、检查速度快、无损伤等优点，相较于传统的X线、CT和骨密度测量等方法，可以更精确地测量出所需数据，同时兼具三维重建的功能，弥补了二维图像无法判断骨小梁三维结构的不足，在研究骨的结构及力学分析方面得到了广泛的应用[16]。

在此次研究中，我们通过Micro-CT对软骨下骨二维观察、三维重建并检测其显微结构，发现在造模9周后模型组兔膝关节二维冠状面出现骨小梁排列不均，断裂融合等现象，三维重建显示骨髁边缘骨赘增多，显微结构显示软骨下骨Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均明显升高，Tb.Sp明显降低，是中晚期KOA的明确特征[17]。证明在异常机械应力的作用下，软骨下骨出现了结构上的改变，干预治疗后，针刀和电针组兔膝关节软骨下骨骨赘明显减少，Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均显著降低，Tb.Sp升高，针刀组较电针组改善趋势更明显，证明针刀可改善软骨下骨骨形成。

KOA属中医学“膝痹病”的范畴，随着病程的进展病位由“筋”发展至“骨”。《素问·痿论》曰“宗筋主束骨而利机关也”，阐明了筋的作用，即“筋”发生病变，其协理关节的功能失常，若不加以干预将进展发生“骨病”，而“骨病”又会反作用于筋，加重“筋伤”，二者相互影响，最终导致“筋错缝”“骨出槽”的病理状态。《素问·调经论》中指出“病在筋，调之筋；病在骨，调之骨”，是后世有效治疗KOA的思路来源。针刀在临床上的治疗原则不仅仅是对压痛点及因应力失衡代偿形成的条索状物进行“燔针劫刺”，还对周围与维持膝关节生物力学平衡起关键作用的软组织进行松解，进一步达到“调筋”的目的，通过重塑关节内部的良性应力平衡，有效缓解软骨下骨异常重塑和软骨降解从而达到“治骨”的目的，为打破“筋骨同病”的恶性循环提供突破口，对治疗KOA有重要意义。

二磷酸盐是一种有效的骨吸收抑制剂，主要作用是抑制破骨细胞的降解活性，可以有效减少软骨下骨骨量的丢失，使软骨下骨微结构维持正常状态[18]，但在本次实验中，骨代谢调节剂组与模型组各项数据均未见显著差异，我们推测可能是因为二磷酸盐的抑制作用主要针对破骨细胞，而本实验造模9周后模型兔KOA已发展至中晚期，软骨下骨以成骨细胞的成骨作用为主，主要表现为异常骨形成，因此二磷酸盐的作用不明显。

综上所述，针刀通过对膝关节局部组织进行松解，可有效改善中晚期软骨下骨的异常骨重塑，延缓KOA的进展，对于治疗KOA有重要意义。