丹酚酸B-黄连素复合物对糖尿病小鼠肾损伤及SIRT1/PGC-1α信号通路的影响*

胡媛媛 暴雪丽 武彦香 连 娟 祝嘉健 郑春燕 胡雪红 姜广建△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）

由于饮食和生活方式的改变，糖尿病的发病率逐年上升，预计到2045年全球糖尿病患者将达到6.93亿[1]。此外，由糖尿病引起的一系列包括糖尿病性肾病（DN）等疾病在内的各类临床并发症也严重威胁着糖患者的生命健康。

黄连素是黄连的主要有效成分，具有降糖、降脂、抗炎等多种药理作用[2]。丹酚酸B主要是从丹参的根及其枝干中提取得到的活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等多种药理活性[3]。研究表明，黄连素可抑制氧化应激和醛糖还原酶，常用于DN的治疗[4]；SalB可明显减轻糖尿病大鼠肾纤维化，其机制与改善氧化应激状态相关[5]。前期研究表明，黄连素和丹酚酸B均具有改善糖尿病肾损伤的作用，但两者的复配是否能通过调控沈默信息调节因子α相关酶1（SIRT1）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）信号通路从而协同改善糖尿病肾损伤的结果尚不清楚。本研究通过观察黄连素、丹酚酸B及其复合物对糖尿病小鼠SIRT1/PGC-1α信号通路相关蛋白的调控，探讨其复合物对糖尿病肾损伤的效用机制，以及其是否能在糖尿病的治疗中达到协同增效的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自北京斯贝弗生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养条件：温度（23±2）℃，湿度（55±10）%，自由进食进水，12 h光暗交替循环。伦理批号：BUCM-4-2016061701-3001。高脂饲料、标准饲料（江苏医药生物医学有限公司）。

1.2 药物 丹酚酸B、黄连素（纯度98%，成都普瑞法科技开发有限公司）。所需浓度的悬浮液用超纯水制备。

1.3 试剂与仪器 血清肌酐（Scr）、血清尿素（Urea）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PGC-1α、SIRT1（Proteintech公司）；伊红染色液、苏木素染色液（北京索莱宝生物科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；小鼠二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒、兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（北京翱擎生物科技有限公司）；RM 2255轮转式切片机（Leica Biosystems有限公司）。

1.4 模型制备 适应性喂养1周后，对8周龄雄性C57BL/6J小鼠进行45%高脂饮食（HFD）喂养12周。12周后，禁食不禁水12 h，剪尾采血测定血糖值在10.0 mmol/L以上为建模成功[6]。

1.5 干预方法 将成模小鼠随机分为模型组、丹酚酸B+黄连素组、黄连素组、丹酚酸B组，每组6只。丹酚酸B+黄连素组：丹酚酸B 100 mg/kg+黄连素50 mg/kg。丹酚酸B组：丹酚酸B 100 mg/kg。黄连素组：黄连素50 mg/kg。灌胃给药，连续8周（每日1次）。给予正常组及模型组等体积生理盐水。

1.6 观察指标 1）空腹血糖及生化指标检测：末次给药后，禁食不禁水12 h，检测空腹血糖（FBG）；摘眼球取血，试剂盒检测血清Scr、Urea的水平。2）组织病理学检查：将固定液中的肾脏组织脱水、透明、包埋、切片，行苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察各组肾脏组织的病理改变。3）免疫组织化学：将肾脏切片脱蜡至水，在柠檬酸钠缓冲液中煮沸8 min，加入过氧化氢溶液，阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭1 h，滴加一抗[PGC-1α（1∶200）、SIRT1（1∶200）]，4 ℃过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。并采用Image-ProPlusv6.0软件对图像进行分析。4）Western blotting法检测SIRT1及PGC-1α的表达：测定小鼠肾脏组织的蛋白浓度。通过10%SDS-PAGE分离已变性的蛋白质样品，将其转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h。添加一抗SIRT1（1∶800）、PGC-1α（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000），4 ℃过夜。取出条带，TBST洗涤3次，室温孵育对应的二抗（1：5 000）1.5h。TBST洗涤3次，显色，曝光。采用ImageJ对图像进行分析。

1.7 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，对非正态分布或方差不齐的数据进行非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平的比较 见表1。结果显示，与正常组相比，模型组小鼠FBG、Scr及Urea水平均明显上升（P＜0.05）。与模型组相比，丹酚酸B+黄连素组小鼠FBG、Scr及Urea水平均显著下降（P＜0.05）；黄连素组血清Urea水平明显下降（P＜0.05）。已知血清肌酐和血清尿素是评估肾损伤的指标。结果提示，丹酚酸B和黄连素的复合物有明显的降糖作用，并能明显减轻糖尿病小鼠的肾损伤。

表1 各组小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平比较（±s）

表1 各组小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组 别n Scr（μmol/L）Urea（mmol/L）FBG（mmol/L）正常组模型组丹酚酸B+黄连素组黄连素组丹酚酸B组6 6 6 6 6 6.17±1.47 9.83±1.94*5.83±2.40△7.33±1.37 7.83±1.17 2.80±0.72 4.74±1.61*2.55±0.93△2.95±0.45△3.30±0.59 5.74±0.27 10.48±4.12*6.26±0.42△6.94±0.73 7.30±1.15

2.2 各组小鼠肾脏形态学的比较 光镜下：与正常组对比，模型组小鼠的肾脏组织进行HE染色后临床表现为肾小球肥大，系膜基质增多，系膜区增宽变厚，系膜细胞增生。治疗后，丹酚酸B+黄连素组、黄连素组和丹酚酸B组肾小球肥大及系膜增生的症状有明显的减轻，其中丹酚酸B+黄连素组改善最为明显。见图1。

图1 各组小鼠肾脏病理改变光镜图（HE，400倍）

2.3 各组小鼠肾脏组织PGC-1α、SIRT1的表达情况比较 见表2。与正常组相比，模型组小鼠肾脏组织中PGC-1α及SIRT1的蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）。与模型组相比，丹酚酸B+黄连素组中PGC-1α及SIRT1的蛋白表达水平均显著上升（P＜0.05）；黄连素组中PGC-1α及SIRT1蛋白的表达较模型组均明显上升（P＜0.05）；丹酚酸B组中SIRT1蛋白的表达较模型组显著上升（P＜0.05）。结果提示，黄连素、丹酚酸B及其复合物可不同程度上使糖尿病小鼠肾脏中PGC-1α及SIRT1的表达增加，其中黄连素、丹酚酸B的复合物效果最为显著。

表2 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达比较（±s）

表2 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达比较（±s）

组别正常组模型组丹酚酸B+黄连素组黄连素组丹酚酸B组n 6 6 6 6 6 PGC-1α 0.105±0.008 0.073±0.003*0.109±0.004△0.091±0.006△0.088±0.002*SIRT1 0.087±0.002 0.057±0.005*0.085±0.001△0.076±0.005*△0.074±0.003*△

2.4 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达比较 见表3，图2。与正常组相比，模型组小鼠肾脏组织中PGC-1α及SIRT1的蛋白表达水平均明显下降（P＜0.05）。与模型组相比，丹酚酸B+黄连素组及黄连素组中PGC-1α及SIRT1的表达均明显上升（P＜0.05）；丹酚酸B组中PGC-1α的表达较模型组均明显上升（P＜0.05）。结果提示，黄连素、丹酚酸B及其复合物可不同程度上使糖尿病小鼠肾脏中PGC-1α及SIRT1的蛋白表达增加，其中黄连素、丹酚酸B的复合物效果最为显著。

表3 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达比较（±s）

表3 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达比较（±s）

组别正常组模型组丹酚酸B+黄连素组黄连素组丹酚酸B组n 6 6 6 6 6 PGC-1α 1.05±0.05 0.37±0.01*1.20±0.03△0.90±0.21△0.83±0.19△SIRT1 0.62±0.16 0.26±0.05*0.68±0.08△0.61±0.06△0.47±0.09

图2 各组小鼠肾脏组织中PGC-1α、SIRT1蛋白的表达

3 讨 论

糖尿病属中医学“消渴”范畴，中医学认为消渴的病机多是阴津亏损，燥热偏盛（阴虚为本、燥热为标）。“内热”为其主要病机之一，治疗当以清热为主[7]。黄连苦、寒，善清中焦胃热，符合消渴病胃热炽盛（中消）的核心病理机制。消渴病日久，易耗伤津液，使血液运行不畅而致血脉瘀阻。血瘀亦是消渴病的关键病理机制之一，且血瘀与消渴病多种并发症的发生紧密相关。而丹参具有良好的活血祛瘀作用，祛瘀生新而不伤正，是临床治疗血瘀症的首选之药。现代药理研究显示，黄连素为黄连的主要有效成分，具有多种生化和药理作用，如降脂和抗糖尿病活性[8]。丹酚酸B是丹参提取物中的一种，对肾细胞具有抗炎、抗氧化作用[9]。基于此，选择以复合物的形式进行干预，以起到协同增效的作用。

DN是与终末期糖尿病相关的最严重的继发性并发症之一，影响了将近1/3的终末期糖尿病患者[10]。高血糖所致的氧化应激是导致DN肾损伤的核心发病机制之一[11]。足细胞损伤是慢性肾脏疾病的重要病理机制之一，并最终可能导致DN的发展[12]。而氧化应激被认为可能是导致足细胞损伤的主要原因之一[13]。既往研究表明，黄连素可通过抑制氧化应激来改善足细胞损伤[14]，并能抑制高脂饮食和STZ诱导的DN大鼠的肾损伤[8]。而大剂量的丹酚酸B则在足细胞内具有抗氧化应激的功效，这种功效可通过抑制ROS的生成来实现[15]。

SIRT1/PGC-1α是抗氧化损伤的重要内源性通路之一，PGC-1α活性可被SIRT1激活并参与多种生物学途径，如细胞凋亡、能量代谢、氧化应激等[16]。PGC-1α主要存在于富含线粒体的组织中，其主要功能就是通过刺激线粒体进行生物合成以调节能量代谢[17]。研究证明，PGC-1α是线粒体生物发生进程中的一个关键介质[18]。线粒体功能障碍将会产生过多的ROS，最终引起氧化应激[19]。研究发现，PGC-1α介导的氧化应激与糖尿病及其并发症密切相关，包括DN[20]，并能在DN模型中观测到PGC-1α蛋白表达的下降[21]。因此，PGC-1α可能成为肾功能损伤的一个关键靶点，并且SIRT1/PGC-1α信号通路可能在DN氧化应激中起关键作用。体外实验亦证实，可通过诱导PGC-1α促进线粒体生物合成，保护线粒体功能，对抗氧化应激的损伤[22]。本次实验结果表明，与模型组相比，黄连素、丹酚酸B的复合物进行干预治疗后肾脏组织中SIRT1及PGC-1α的表达显著上升，且效果明显优于丹酚酸B组和黄连素组，提示黄连素、丹酚酸B及其复合物在糖尿病小鼠中可能通过调节SIRT1/PGC-1α蛋白的表达，进而减轻氧化应激的损伤，保护足细胞，改善肾脏的损害程度，防止病情进一步向DN发展，并且黄连素、丹酚酸B复合物的效果更为显著。

综上所述，黄连素、丹酚酸B的复合物可显著上调糖尿病小鼠肾脏组织中SIRT1/PGC-1α蛋白的表达，能明显改善肾脏组织的病理损害，一定程度上可防治DN。