通冠胶囊对气虚血瘀致心衰的保护作用实验研究*

谭亚芳 黄昭龙 祁建勇 于 娟 张敏州△

（1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510006）

近年来，心血管疾病的患病率和死亡人数不断上 升，其中心衰是心血管疾病中造成死亡的重大原因之一，严重危害人类健康[1-3]。中医学认为心衰病机演变主要为“气虚-血瘀”[4]。通冠胶囊是根据邓铁涛教授学术思想和临证经验拟方而成，由黄芪、丹参、水蛭等组成，秉承益气活血通络的治法，在防治急性心梗、冠脉再狭窄方面，有良好的作用。GATA4在心血管疾病发挥重要作用[5-7]，是多种刺激和信号通路的下游效应因子。GATA4转录活性可被病理性刺激相关的多个信号通路正性调节，如ERK1/2、p38、Akt及CnA/NFATc3通路[8-11]等。本研究以通冠胶囊为干预药物，探究ERK1/2/GATA4信号通路与气虚血瘀致心衰的关系，阐明通冠胶囊治疗气虚血瘀致心衰的相关机制，为心衰的治疗提供新的作用靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性18个月龄C57BL/6J老年小鼠48只（批号：44002100015531），均购于广东省医学实验动物中心，经过严格及合格的检疫。实验及饲养方案均遵照《中华人民共和国动物处理条例》（条例号：552001），并且所有动物实验均在广东省中医院动物伦理委员会允许下进行。

1.2 药物与试剂 通冠胶囊主要由黄芪、丹参、水蛭、冰片组成，由广东省中医院生产，批准文号：粤药制字Z20071034，生产批号：050802。异丙肾上腺素（SIGMA公司），美托洛尔（SIGMA公司），P-ERK抗体（Cell Signaling Technology，美国），GATA4抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国），GAPDH抗体（Cell signaling Technology，美国），鼠二抗（Cell signaling Technology，美国），兔二抗（Cell signaling Technology，美国）。

1.3 模型制备 本实验采用的雄性18个月龄的C57BL/6J老年小鼠在中医辨证中属于气虚证候，心力衰竭在中医理论中属于血瘀证，通过皮下注射异丙肾上腺素（30 mg/kg）造成的老年小鼠心衰模型即可辨证为气虚血瘀致心力衰竭模型，小鼠左心室射血分数下降至45%以下，左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径均增大，可判断模型复制成功[12-14]。

1.4 分组及给药 将48只C57BL/6J老年小鼠随机分成空白对照组、模型组、通冠胶囊组、美托洛尔组，各12只。实验第1周连续7 d给药，通冠胶囊组灌胃通冠胶囊0.5 g/kg，美托洛尔组腹腔注射美托洛尔30 mg/kg，每天1次。第2周继续给药，除空白对照组外，其他3组同时皮下注射异丙肾上腺素30 mg/kg，每天1次。空白对照组生理盐水灌胃1 mL，每天1次，持续2周。

1.5 标本采集与检测 1）给药结束后，各组小鼠进行心脏超声，检测指标包括左室舒张末前壁厚度（LVAWd）、左室收缩末前壁厚度（LVAWs）、左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末后壁厚度（LVPWd）、左室收缩末后壁厚度（LVPWs）、射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）。2）超声结束后，处死小鼠取心、肺等组织，迅速称量，同时解剖胫骨，游标卡尺读出长度，计算心/胫比，肺/胫比。最后1 d禁食12 h，灌胃给药2 h后注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，解剖心肝肺后称重，心脏快速称重，切取左心室置于液氮中-80℃保存。3）将保存于-80℃冰箱中的小鼠心脏样本取出后，于冰上切取约100 mg心脏组织。以眼科剪剪碎组织于匀浆管，加入1 mL裂解液，于匀质仪至匀浆完全；于冰上裂解30 min，再次匀浆。匀浆后于4℃以12 000 r/min速度离心5 min，取上清液；BCA法测定细胞裂解液中蛋白浓度，计算上样体积。蛋白上样，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h，加入相应稀释比例的第一抗体，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，更换二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液处理，化学发光成像仪检测，以GAPDH为内参，分析P-ERK及GATA4蛋白的表达情况。

1.6 统计学处理 应用SPSS18统计软件。采用LSD-t的方法对各组数据进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心脏超声数据比较 见表1。与空白对照组比较，模型组 LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF、FS均有明显减小（P＜0.01），LVIDs有明显增大（P＜0.01）。与模型组比较，通冠胶囊组LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF、FS均有明显增大（P＜0.01），LVIDs有明显减少（P＜0.01），但通冠胶囊组与空白对照组以及美托洛尔组比较，以上指标皆无明显差异（P＞0.05）。1个心动周期内，模型组的左室腔室在舒张期到收缩期的变化幅度比空白对照组小；通冠胶囊组与模型组比较，幅度变大，并且通冠胶囊组与空白对照组及美托洛尔组比较，变化幅度差别不明显。

表1 各组小鼠心脏超声数据比较（±s）

表1 各组小鼠心脏超声数据比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.01。下同。

组别空白对照组模型组美托洛尔组通冠胶囊组n 12 12 12 12 LVAWd（mm）0.696±0.001△0.558±0.025 0.693±0.001△0.701±0.002△LVAWs（mm）1.054±0.007△0.765±0.062 1.075±0.001△1.031±0.005△LVIDs（mm）2.444±0.003△2.850±0.081 2.442±0.008△2.449±0.007△LVPWd（mm）0.705±0.001△0.580±0.029 0.704±0.001△0.706±0.002△LVPWs（mm）1.023±0.006△0.753±0.055 1.040±0.007△1.008±0.003△EF（%）59.669±0.298△41.580±2.652 60.607±0.431△58.489±0.296△FS（%）30.977±0.213△19.860±1.466 31.648±0.302△30.150±0.205△

2.2 各组小鼠心/胫比、肺/胫比较 见表2。模型组心/胫比及肺/胫比与空白对照组比较明显增大（P＜0.05），进一步说明造模成功。通冠胶囊组及美托洛尔组的心/胫比及肺/胫比与模型组比较明显减小（P＜0.05），但通冠胶囊组与美托洛尔组比较无统计学差异（P＞0.05），这说明通冠胶囊能够改善心肌重构情况，进而改善心衰。

表2 各组小鼠心/胫比、肺/胫比的比较（±s）

表2 各组小鼠心/胫比、肺/胫比的比较（±s）

组别空白对照组模型组美托洛尔组通冠胶囊组n 12 12 12 12心/胫比0.075±0.0112△0.096±0.010 0.081±0.009△0.083±0.010△肺/胫比0.081±0.007△0.098±0.004 0.087±0.005△0.085±0.003△

2.3 各组小鼠P-ERK以及GATA4表达量比较 见图1，表3。模型组P-ERK以及GATA4表达量与空白对照组比较均明显增加（P＜0.05），说明ERK1/2/GATA4通路与气虚血瘀致心衰密切相关。通冠胶囊组及美托洛尔组的P-ERK以及GATA4表达量与模型组比较明显减少（P＜0.05），且通冠胶囊组与美托洛尔组比较，P-ERK以及GATA4的表达量均无明显差异（P＞0.05）。

图1 各组小鼠P-ERK及GATA4表达条带

表3 各组小鼠P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值（±s）

表3 各组小鼠P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值（±s）

组别空白对照组模型组美托洛尔组通冠胶囊组n 12 12 12 12 P-ERK/GAPDH 0.507±0.115△1.110±0.227 0.660±0.070△0.550±0.044△GATA4/GAPDH 0.634±0.092△1.162±0.329 0.588±0.084△0.547±0.058△

3 讨 论

通冠胶囊秉承中医益气活血的治疗思路，在中医理论指导下，采用多种益气活血中药炮制而成，包括了黄芪、丹参、水蛭和冰片。黄芪补中益气为君药；丹参活血化瘀为臣药；水蛭破血逐瘀通络，冰片通窍，共为佐使；4药共奏益气活血、祛瘀通脉之功。

本课题组前期实验研究发现通冠胶囊对小鼠心肌缺血再灌注损伤有治疗效果[13]。本实验采用雄性18个月龄的C57BL/6J老年小鼠皮下注射ISO的方法造模，能够稳定地复制出心衰模型。ISO引起的心梗后心衰是一个成熟可复制的心衰模型，伴随心脏肥厚、心肌缺血、心肌细胞死亡、心脏纤维化和心律失常。儿茶酚胺类血管活性剂可调节心功能。低剂量时，它们会产生正性肌力作用；而大剂量时对心脏有损伤作用。ISO是一种合成的儿茶酚胺和肾上腺素能激动剂，能诱导大鼠心脏损伤。本次实验建立的气虚血瘀致心力衰竭模型通过实验验证造模成功，并且在心衰病变进程中，属于失代偿期的心衰。

本实验通过整体水平和分子水平两个层面来分析通冠胶囊的作用，小鼠超声结果表明，通冠胶囊组的LVAWd、LVAWs、LVIDs、LVPWd、LVPWs与模型组具有明显统计学差异。其中，通冠胶囊组的LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs较模型组增大，通冠胶囊组的LVIDs与模型组比较减小，通冠胶囊组的LVAWd、LVAWs、LVIDs、LVPWd、LVPWs与美托洛尔组相比较不具有统计学差异，并且通冠胶囊组与对照组比较，以上指标均无统计学差异，这说明通冠胶囊组的左心室腔室缩小到接近正常水平。通冠胶囊组的EF、FS与模型组具有明显统计学差异，通冠胶囊组的EF、FS与模型组比较增大，通冠胶囊组的EF、FS与美托洛尔组比较不具有统计学差异，并且通冠胶囊组与对照组比较，以上指标均无统计学差异，这说明了通冠胶囊组小鼠心脏收缩力恢复至接近正常水平。小鼠取材结果表明，通冠胶囊组的心/胫比以及肺/胫比与模型组比较具有统计学差异，通冠胶囊组的心/胫比以及肺/胫比均比模型组的小，并且通冠胶囊组的心/胫比以及肺/胫比与美托洛尔组以及空白对照组比较，以上指标均无统计学差异，这说明心肌肥大与心衰的情况正在改善。综上，我们可以在整体水平说明通冠胶囊具有改善气虚血瘀致心衰的作用。Western blotting的结果表明，通冠胶囊组的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值与模型组比较具有统计学差异，通冠胶囊组的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值均比模型组小，并且通冠胶囊组的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值与美托洛尔组以及空白对照组比较，以上指标均无统计学差异，因此，我们认为ERK1/2/GATA4信号通路与气虚血瘀致心力衰竭的病变过程密切相关，气虚血瘀过度激活ERK1/2/GATA4信号通路，导致心肌重构，进而引起心衰的发生。

课题组前期研究发现，通冠胶囊能减小心肌梗死面积，改善心梗后心功能，通过调节自噬减少心肌细胞凋亡。并且通冠胶囊能抑制心房纤维化及心室纤维化，减少房颤及室性心律失常的发生率。本研究同样证实，通冠胶囊对气虚血瘀致心力衰竭有改善的作用，其干预作用的分子机制是通过抑制ERK1/2/GATA4信号通路，降低P-ERK的表达，然后根据P-ERK与GATA4的正向调节关系，减少GATA4的表达量，最终改善心肌重构情况，从而达到治疗心衰的效果。