埃博霉素D对大鼠外伤性视神经损伤的保护作用

外伤性视神经损伤（TON）是一种针对于视神经的急性损伤，可导致患者失明。直接或间接的外力作用于视神经可立即引发初级损伤，即大量的炎性细胞浸润导致视神经管水肿，压迫毛细血管引发缺血性坏死。随着炎症的蔓延，凋亡相关因子上调诱发残存视网膜RGC发生继发凋亡，该过程称之为二次损伤。视神经属于中枢神经系统，损伤后将难以修复再生。现阶段对TON的治疗策略主要为降低二次损伤的程度和保护残存的RGC，包括高剂量的糖皮质激素，视神经管手术减压和上述两种治疗的组合。虽然上述治疗方法在一些情况下能有效减低TON的二次损害程度，但TON发生常伴随严重事故或头面部损害，常错失治疗时机且一些患者对现有治疗方案响应不佳，此外长期大剂量注射糖皮质激素可导致患者生命质量的下降，因此治疗TON函待探索新的方案。

随着现代生物医学的发展，一些生物活性物质，例如小分子化合物，神经生长因子，神经保护因子，干细胞，外泌体等制剂在动物TON或神经系统损伤模型上展现出令人鼓舞的疗效。埃博霉素（EPOs）是一种紫杉醇类小分子化合物，研究发现此类化合物具有很强的微管稳定作用，其与细胞内β-微管蛋白结合时抑制微管解聚，增强微管柔韧性，阻碍细胞有丝分裂，诱发细胞凋亡，被运用于治疗多种肿瘤疾病。由于大多数神经系统损伤中会涉及到神经元微管稳态破坏，微管相关蛋白异常修饰和累积，纤维瘢痕的形成等分子和病理变化，因此运用埃博霉素在微管稳定方面的作用来治疗中枢神经系统损伤，外周神经系统损伤和慢性神经系统退行性疾病被认为是潜力巨大的。研究发现，TON后视网膜RGC合成能力受到干扰，胞体中微管相关蛋白Tau（一种微管稳定分子）含量降低，而视神经轴突中则显著增加。上述研究表明TON后视神经胞体的Tau蛋白合成受阻，不能产生足够的Tau来稳定微管，而随着微管崩解和Tau清除机制的丧失，受损轴突中开始累积大量的Tau，最终诱发形成神经纤维缠结，阻碍神经元的修复和再生。

由于视觉通路的精妙性和视神经损伤病理变化的特殊性，埃博霉素D在视神经损伤修复方面尚未进行过探索。因此，本研究构建大鼠TON模型，腹腔注射埃博霉素D进行治疗，观察药物治疗前后模型动物在视神经传导通路FVEP指标，视网膜RGC的数量，视网膜和视神经中Tau蛋白水平及其磷酸化水平，以及受损部位神经元再生信号GAP43的表达情况。探索TON后外源补偿微管稳定分子能否减少视网膜神经元细胞的继发死亡，改善视网膜和视神经的微管稳定相关蛋白表达模式，从而激发神经元的再生。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本研究采用实验动物为SPF级雌性健康成年Sprague-Dawley大鼠42只，体质量180～200 g。所有实验动物由昆明医科大学实验动物中心提供，且本研究经昆明医科大学动物实验伦理审查并通过（伦理审查批号KMMU2013017），本实验的动物操作人员具有云南省实验动物协会颁发的从业资格证。实验方案考虑了实验动物福利原则，但因FVEP检测对动物麻醉状态敏感，在不影响动物取食的前提下，为提高测量准确性和实验结果的可重复性，故采用左眼手术操作和右眼进行假手术在同一个体上进行的实验策略。

（2）若國主能肅温，又良哲恭清儉聖讓者，皇極建也。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷一，《中华道藏》30/532）

1）基肥用量。一般矮化幼龄树亩施优质有机肥2 000～2 500 kg；乔化幼龄树亩施优质有机肥1 500～2 000 kg；成龄矮化树亩施优质有机肥2 500～3 000 kg；成龄乔化树亩施优质有机肥 2 000～2 500 kg。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 42只健康SD大鼠随机分成治疗组和溶剂（DMSO）对照组，21只/组，在同等条件下进行饲养。从治疗组和对照组中随机分别随机挑选3只个体行FVEP模型构建（需在TON建模前1周进行），FVEP模型构建方法参照本实验室前期研究。SD大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射（0.4 g/kg，约0.4 mL）麻醉后，备皮固定于脑定位仪上，用组织剪分离暴露颅骨，直至清晰辨认前后囟门，调整定位仪确定电极植入点（阴极为前囟点向前3 mm，阳极为向后7 mm左右旁开3 mm），用颅钻在电极点处植入电极并覆盖牙科义齿树脂，待凝固后，向每只大鼠行大腿一次性肌注200 000 U/mL浓度的青霉素G钾200 μL。完成FVEP模型后恢复1 周以备TON建模，期间观察是否感染。TON建模前日首次给予1.0 mg/kg 剂量腹腔注射埃博霉素D 或等量DMSO溶剂，次日建立大鼠外伤性视神经损伤模型，模型构建方法参考本实验室前期研究。大鼠麻醉后（方法同前），左眼滴若干滴盐酸奥布卡因，剪开左眼外眦约2 mm，向后方钝性分离眼外直肌，暴露视神经3～4 mm，用50 g的夹持镊在眼球后约2 mm处钳夹视神经10 s。右眼为假手术眼，仅分离暴露视神经，不行钳夹损伤。首次注射后3 d/次注射治疗至28 d，溶剂对照组给予相同体积的DMSO腹腔注射。TON建模中左眼行视神经夹挫伤处理，右眼行假手术处理。

1.2.7 Western blot 检测TON 大鼠视神经及视网膜中Tau 及pTau-396/404 蛋白水平 本研究运用Western blotting探索TON后不同时间点（3、7、28 d）药物对比溶剂组对损伤眼视网膜和视神经中Tau及其磷酸化pTau-396/404的改变情况。此外考虑到埃博霉素对微管的强力稳定作用，正常眼可能会受到药物的影响，因此我们以溶剂组3d时间点的假手术右眼作为正常对照，探索药物对正常眼的是否产影响。Western blot检测流程为：按快速制备试剂盒说明书配制10%PAGE凝胶；上样并电泳，90 V 30 min后120 V 90 min，待溴酚蓝指示剂刚跑出玻璃夹层即可终止电泳，进行转膜90 V 90 min；转膜结束后分别切取内参及目的条带，于摇床上用PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；5% BSA，37 ℃摇床封闭1 h，于摇床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；于摇床4℃过夜孵育一抗，GAPDH（1∶1000），Anti-Tau（phospho S396）（1∶2000），Anti-Tau（phospho S404）（1∶2000），Anti-Tau 抗体（Tau-5）（1∶2000）；次日，于摇床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；添加二抗（1∶20 000）室温摇床孵育1 h，于摇床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；随后用ECL化学发光试剂显影。蛋白样本检测进行独立3次重复实验。运用Image J软件进行灰度扫描，经内参校准后进行蛋白表达差异分析。

1.2.6 RGC计数 本研究将拍摄的固定显微倍数下视网膜神经节细胞层作为测量目标，用Photoshop CS6 的测量工具测量各摄片中无脱片、破碎、折叠、撕裂等一系列异常情况视网膜长度。对每个个体的每枚眼球切片统计全视网膜约12～15 张具有重叠区的摄片，累积得出各眼球的有效视网膜总长。以DAPI 指示细胞核，以NeuN 指示RGC，必须满足共定位的亮点才判定为RGC。且NeuN的亮点强度所反映出的RGC数目，根据DAPI 细胞核大小进行确定。由于RGC数量变量在个体内部左右眼的差异比在个体之间的差异小。因此，RGC 的计数以右眼假手术组眼球进行对照，统计左眼损伤后相较于对照右眼时的RGC的丢失率，即（左眼-右眼）/右眼。

观察组1、2的腓总神经、胫后神经CSA、D1、D2等数值与对照组相比均较高，且P＜0.05；而观察组2各数值与观察组1相比较高，且P＜0.05。见表。

1.2.4 视网膜/视神经组织冰冻切片制作 处死大鼠后快速取出眼球，用1 mL 注射器沿角膜中央刺入2 mm并注入4%多聚甲醛固定液，灌洗眼球内液体，待眼球内液体全部置换后置入含有2 mL 4%多聚甲醛的EP 管内，用棉花压住管口保持眼球完全浸入液体。等待眼球自然沉底后将眼球浸入20%蔗糖溶液中脱水2 h，随后置入30%蔗糖溶液中继续脱水约24 h。待30%蔗糖溶液中眼球沉底后，取出眼球，沿眼球冠状面分离出眼球角膜、虹膜及晶状体，将包埋剂填充至眼球内，并侧放在事先预冷好的-25 ℃载物台上，冷冻约5 min。待眼球固定好后，即可载入进行切片，切片厚度约6～8µm，视网膜修片至中轴附近出现视乳头区，视神经修片至中轴处，将制作好的切片放入-80 ℃冰箱备用。

1.2.5 免疫荧光染色 从-80 ℃取出切片，冷却至室温；用PBS清洗3次，5 min/次；5%山羊血清封闭60 min，用PBS清洗3次，5 min/次；孵育一抗4 ℃过夜［突触生长标志物检测采用Anti-GAP43（1∶1000）；观察视网膜中RGC数目采用Anti-NeuN（1∶1000）］；次日取出孵育的切片室温复温1 h，PBS清洗3×5 min；加入对应种属二抗（1∶1000）于37 ℃孵育1 h，随后用PBS清洗3次，每次5 min；DAPI核染并封片（注意避免气泡产生）于荧光显微镜下观察并摄片。

1.2.3 数据与样本采集 FVEP数据采集治疗组及溶剂对照组中FVEP建模的各3只个体的1 d及28 d数据，28 d检测数据完成后安乐死（过量2%戊巴比妥2 mL腹腔注射，断颈处死）。剩余大鼠的治疗组（=18）和对照组（=18）中按照3、7、28 d这3个时间点分别随机挑选出6只大鼠进行取材（处死方式同前）。其中3只取眼球和视神经进行冰冻切片制作和荧光染色，另外3只取视网膜和视神经进行蛋白质提取。FVEP检测方法，取材方法及蛋白提取方法参照本实验室前期研究方法。

1.2.2 药物剂量与观察节点 埃博霉素D于紫杉醇化合物类似，存在药物剂量依赖效应。高浓度的药物常用于癌症治疗且会过稳定微管，反而会抑制轴突功能产生神经疼痛；而低剂量的药物会促进神经元轴突生长，对轴突生长锥微管适度稳定，并在受损的脊髓轴突中保持微管的稳定性和集束性。有研究表明，小鼠以1～3 mg/kg的剂量行每周1次腹腔注射可有效发挥药物作用且不产生明显副作用，依据《药理实验方法学》中的体表面积估算法，计算大鼠剂量为1次/周腹腔注射0.69～2.1 mg/kg，故本研究中选择1.0 mg/kg腹腔注射，3 d/次。相关文献在运用不同药物探索性治疗大鼠TON研究中采用的疗效观测终点不同，如观察至14 d以及28 d，而在评价埃博霉素D治疗外周神经系统损伤中发现28 d时即有展现出治疗效果，因此本研究探索埃博霉素D治疗大鼠TON后视神经损伤修复观察终点为28 d。

本例中，中国法官所说的最后“陈述”是一个具有文化特性的词，译员为了消除被告的理解障碍，在口译时增加了必要的信息：“如果你对判决有任何要求和希望，你可以向法庭提出要求和希望。”在许多情况下，当译员一时难以找到对应词时，可以直接通过解释来调解。比如，翻译一个地名时，译员可以在保留原来的发音时，解释说“这是一个地方的名称”。这样的调解策略有利于保证各方沟通的流畅而不影响庭审的节奏。

大鼠TON后视网膜RGC在溶剂对照组中呈现逐渐丢失的现象（图2B），其3～7 d期内丢失增速不明显，28 d时丢失率可达61.16%（图2A）。RGC计数以右眼假手术组进行统计矫正对照，统计左眼损伤后相较于右眼不损伤时的RGC丢失率。实验结果表明3 d 治疗组与溶剂对照组RGC 丢失率差异有统计学意义（=0.032），7 d治疗组与溶剂对照组RGC丢失率差异无统计学意义（=0.054），28 d治疗组与溶剂对照组RGC丢失率差异有统计学意义（=0.042）。

2 结果

2.1 埃博霉素D 治疗大鼠TON 的FVEP 检测

对侧眼（假手术眼）存在典型的FVEP闪光电信号，可见埃博霉素D未有对假手术眼造成不良影响（图1C）；对于N2波延迟相对变化值来说，1 d和28 d时治疗组与溶剂组均未检测出明显的差异（图1A、B）；对于损伤眼相对于对侧眼的P2-N2波振幅的相对缩减值来说，治疗组出现缩减值降低的趋势，但差异无统计学意义（均＞0.05，表1）；观察FVEP闪光电信号波形，溶剂组中手术眼波形较为平直，而埃博霉素D治疗组中手术眼波形起伏。

大鼠TON用埃博霉素D治疗后视网膜中pTau-396的变化情形与总Tau的变化情况很类似，3 d时pTau-396/404 跟随着总Tau 变化而增多（图3B，C）。pTau-404具有自己的变化特性，在假手术眼当中，摄入埃博霉素3 d后可抑制pTau-404位点的磷酸化（图3C，F）。当损伤之后，除28 d其他时间点的pTau-404磷酸水平或与Tau变化比值都是增加的（图3F）。另外，埃博霉素D对视网膜发挥作用是在TON的早期3 d时，7～28 d时我们没有观察到其与溶剂对照组在总Tau或磷酸化pTau-396/404含量变化上存在明显差异，仅在个别pTau-396/404与Tau变化比值中存在差异。

2.2 埃博霉素D治疗大鼠TON后视网膜RGC存活情况

1.2.8 统计学分析 实验结果采用均数±标准差表示，运用SPSS 20.0 软件进行数据的统计分析，采用Excel 2010软件进行制图。计量数据经Shapiro-Wilk正态性检验结果均符合正态分布，满足方差齐性，。治疗组与对照组的FVEP检测数据以及Western blot条带灰度数据的统计分析采用独立样本检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

2.3 埃博霉素D治疗大鼠TON后视网膜Tau及其pTau-396/404的变化

大鼠TON用埃博霉素D治疗后，3 d时假手术视网膜Tau蛋白明显增多（=0.005，图3A）。用埃博霉素治疗损伤眼后，其视网膜Tau蛋白在3 d时间点上同样大量增多（＜0.001），而在其他时间点上与溶剂对照组未有明显差异（图3A）。

1.1.2 主要试剂及仪器 主要试剂：20%和30%蔗糖溶液，PBST溶液，BSA封闭液。免疫荧光一抗：兔多克隆抗体Anti-GAP43 (Abcam)，兔单克隆抗体Anti-NeuN(Abcam)。免疫荧光二抗：绿色荧光Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(H+L)(life technologies)，红色荧光Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG(H+L) (life technologies)。WB一抗：Anti-Tau（phospho S396）Abcam，Anti-Tau（phospho S404）Abcam；Anti-Tau（Tau-5）Abcam；GAPDH Proteintech 10494-1-AP。WB 二抗：Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）Antibody KPL（214-1516）；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）Antibody KPL（214-1806）。蛋白提取试剂盒：MinuteTM Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells and Tissues Catalog。蛋白酶抑制剂Cocktail（不含EDTA，100 DMSO 储液，bimake），磷酸酶抑制剂Cocktail（100 bimake）。其他：EpiZyme科技PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%），义齿基托树脂，盐酸奥布卡因，青霉素G 钾，Epothilone D（MCE-HY-15278，10 mmol×1 mL in DMSO）。主要仪器设备：瑞沃德脑定位仪，瑞沃德手持钻孔器，眼科罗兰电生理测试仪器，Thermo冰冻切片机，荧光显微镜。

网络信息时代，数据安全问题日益凸显。在社会的各领域当中，如政府机关的财政信息、军队系统的情报信息和内部核心技术、银行系统中的储蓄卡和信用卡网络信息、发展迅速的电子商务等，每天都有用户不断产生和交互大量的数据信息。数据作为信息系统的核心，数据安全是信息安全的核心内容。在信息系统中对数据进行有效保护，是对数据资源完整性、机密性、可用性的保护[1]。

2.4 埃博霉素D治疗大鼠TON后视神经Tau及其pTau-396/404的变化

大鼠TON用埃博霉素D治疗后，3d时假手术眼视神经可见增多的Tau蛋白（=0.018，图4A）。用埃博霉素D治疗损伤眼后，其视神经Tau蛋白在3 d时间点上与溶剂对照组没有明显差异，而在7 d时间点上明显低于溶剂对照组（=0.002，图4A）。在大部分情况下，受损视神经中pTau-396/404含量在治疗组与溶剂对照组间的变化不明显（治疗组pTau-396位点在3d时出现降低，图4B），仅相对总Tau的变化比率上产生波动或小幅度增多（图4E、F）。

未来支撑油价走高有4个主要因素：一是欧佩克和俄罗斯联合减产仍将继续，守卫油价复苏窗口；二是全球原油库存回归5年平均值，助力原油市场重回常态；三是全球上游投资连续3年下降导致新增产量受限，与新一轮减产形成协同效应；四是美国致密油产量递减率增高与成本上升，致使引领非欧佩克国家产量增长能力受限。未来要关注影响国际油价走势的3个不确定性因素：一是关注美伊关系恶化的可能性；二是关注委内瑞拉经济持续恶化导致产量大减；三是关注美国调整货币政策造成油价阶段性回调的可能性。

2.5 埃博霉素D促进TON后大鼠视神经中GAP43的持续表达

用特异抗体标记GAP43检测应用埃博霉素D治疗大鼠TON时的视神经再生情况，结果表明：在夹持后3 d时治疗组和溶剂对照组中的夹持眼视神经均出现大量GAP43的表达（图5），其中GAP43聚集在夹持部位并顺着轴突的延伸向脑部延伸；随着继发损伤的持续，夹持后7 d时在治疗组中虽然GAP43在损伤轴突中的蔓延表达情势减弱但依然可以在夹持部位观察到GAP43的聚集表达，而溶剂对照组的GAP43表达则在整个轴突中均难以检出；在夹持后28d时治疗组依然可以在夹持部位观察到GAP43的聚集表达，少量GAP43信号出现在夹持部位的脑部远端处，而此时的溶剂对照组则难以检出GAP43。

3 讨论

本研究应用埃博霉素D治疗大鼠TON，分析治疗组相对溶剂对照组在FVEP、视网膜RGC数目、Tau蛋白与其磷酸化位点pTau-396/404、视神经GAP43表达水平等指标上的差异变化，探讨治疗手段的有效性。研究表明，治疗组相对溶剂对照组对TON后视网膜RGC保留数目上作用明显，可显著抑制受损眼视网膜RGC的丢失。TON后受损眼会受到多种不同的分子信号和细胞因子的作用，激活以神经炎症、兴奋性毒性和凋亡为主的级联反应，继而发生RGC的二次退行。在大小鼠TON模型中，视网膜RGC通常会在初次损伤后的3～7 d内持续丢失。在本研究中，溶剂对照组夹持眼初次损伤后3～7 d内视网膜RGC的丢失率均达到平均30%，而此时的埃博霉素D治疗组则明显降低了RGC丢失率，降幅分别为63%和56%；而到28 d时，对照组RGC丢失率渐行增加至平均61%，而治疗组在RGC丢失率减低幅度上缩小至37%。通过对降幅的分析发现，埃博霉素D对RGC的存活效用随着时间的推移而减弱。虽然埃博霉素D对受损视网膜中RGC有作用，可提高存活率，但是存留的RGC在生理功能(视觉信号传递)FVEP的N2波延迟和P2-N2波振幅差指标上并未能展现出与溶剂对照组有显著的改善。上述现象产生原因可能是：（1）FVEP各项指标受外部影响因素较多，较少的动物实验个体难以在统计学上获得显著的组间差异性；（2）动物不同个体对TON损伤和药物的作用的响应均一性较差，难以在FVEP中检出统计学差异；（3）RGC的存活与视觉信号通路改善之间的关系较为复杂，视神经损伤后视力恢复需要多个条件，首先是避免损伤后的RGCs的死亡；其次是诱导视神经的修复和再生，视神经在体内保持长距离投射并使其延伸至视神经在中枢神经系统的正确脑区；最后，新生的轴突同靶区域需要产生突触且重新建立正确的连接，以便将视觉信号传输到大脑，最终恢复视觉生理功能。因此，存活的RGC短期内并不一定在视觉功能改善上能有所反映。

从分子层面在视网膜和视神经中分析与埃博霉素D潜在作用相关的微管稳定蛋白Tau的表达模式，结果发现埃博霉素D的摄入会显著增加正常大鼠视网膜和视神经中的总Tau水平，且增加的总Tau并未有发现磷酸化过度增加的情况，这与慢性神经退行性疾病或Tau病模型中运用埃博霉素D抑制过量Tau累积和磷酸化的情况有所不同。研究指出埃博霉素D与紫杉醇稳定微管的作用机制类似，他们与微管的内部位点发生结合，而Tau可以结合在微管的内部与外部。Tau与埃博霉素D在微管的内部结合位点上产生重叠，可产生竞争结合作用。另一些研究发现，Tau的外部结合位点可与埃博霉素类似化合物稳定的微管产生协同作用，Tau可以呈一种低聚物环的形式绑定包围在被稳定的微管外部。因此在正常神经元中，外源增加的微管稳定小分子化合物可在与Tau发生竞争性结合微管的同时，使得Tau单体在未引发多聚化和过度磷酸化的前提下以低聚物形式附着于稳定的微管外围，从而导致神经元总Tau水平在一定程度上的增加。

TON损伤3 d时，视网膜中溶剂组中Tau蛋白的含量急剧降低，暗示轴突的损伤破坏了RGC的代谢模式，损伤RGC无法正常合成Tau，而此时的Tau并未发生广泛地磷酸化，说明胞体中的部分Tau单体可能发生了泛素化降解或受损RGC已经进入了凋亡状态；在药物干预下，视网膜Tau蛋白的水平恢复至同期假手术眼水平，其机制可能是药物分子增加了微管的稳定性，恢复了部分代谢合成功能，抑制了RGC对损伤的应激响应和继发凋亡，这与本研究中用药后RGC存活率增加是一致的。在TON后3D轴突中，溶剂组与治疗组Tau蛋白的变化水平不明显，说明埃博霉素D的保护作用在早期主要针对的是RGC胞体，增加了胞体中Tau蛋白的水平。随着损伤时间推移至7 d，溶剂对照受损轴突中开始出现Tau累积，其原因可能是崩解的轴突中Tau清除机制障碍导致多聚化Tau的累积和神经纤维缠结的形成，而给药组此时间点却显著抑制了轴突中Tau的累积。

目前已有多个针对TON后RGC凋亡现象进行实验性药物/细胞治疗的研究，并展现出了一定的RGC凋亡抑制效果和其他治疗效果。且有研究表明，埃博霉素D对中枢神经系统神经细胞凋亡存在抑制作用，可促进轴突再生。正常状态下的视神经轴突中几乎不表达GAP43。当视神经夹持损伤后，夹持部位会自发诱发GAP43的表达，但是这种表达局限于夹持部位。随着损伤时间的延续，GAP43的表达减弱，且难以穿透夹持部位形成的神经纤维缠结。本研究中运用埃博霉素D治疗大鼠TON，发现在28 d时间点依然可以在夹持部位观察到GAP43的表达，且部分再生的视神经可穿透夹持部位的神经纤维缠结，表明存在部分神经再生。然而值得注意的是，埃博霉素D促再生的程度有限，GAP43并未有广泛的深入至受损轴突远端处，这也可能是FVEP检测不到显著改善的原因之一。