小麦啤酒上面啤酒酵母生成4-乙烯基愈创木酚的条件优化及其发酵动力学模型构建

赵庭，姜琳，贾晶，付为，俞志敏

大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034

0 引言

小麦啤酒是指以小麦芽(占麦芽总质量40%以上)、大麦芽和水为主要原料，添加酒花后，经上面啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵酿造而成的啤酒[1-2]，具有洁白细腻的泡沫、浓郁的香味、强烈的杀口力、适中的苦味、略酸的口感，备受广大消费者青睐[3]。小麦啤酒中富含酸类、脂类、酚类、高级醇类、醛类等风味物质[4-5]，其中，4-乙烯基愈创木酚(4-VG)能够赋予小麦啤酒特有的丁香味和草药香[6-9]，是小麦啤酒中不可或缺的风味物质，也是影响小麦啤酒成品香气形成的关键组分[10]。

阿魏酸主要存在于大麦芽和小麦芽的外层，特别是在富含阿拉伯木聚糖的糊粉层，其含量最为丰富。在小麦啤酒酿造过程中，麦芽中的阿魏酸从阿拉伯木聚糖聚合物中释放出来[11]，酚类异味(POF+)上面啤酒酵母菌株利用苯丙烯酸活性脱羧酶(PAD1)将其脱羧生成4-VG[12]。小麦啤酒中4-VG的含量受酵母菌种、原料组成、糖化工艺和发酵工艺的影响[13]。崔云前[14]研究发现，当醪化液的温度为37 ℃时，有利于肉桂酰酯酶溶出，进而促进阿魏酸释放，使4-VG的合成量达到最大值；小麦啤酒中4-VG的最佳质量浓度为2.0～3.0 mg/L，这既能突出小麦啤酒中特有的丁香味，也不至于使香味太过浓郁。张崇真[10]研究发现，当在原料中添加10%的浅色焦香麦芽时，肉桂酰酯酶的活性最高，4-VG的含量最大。吴幼茹等[15]研究发现，适当添加浅色焦香麦芽可以增加小麦啤酒的整体香味和品质，但用量过多会掩盖小麦啤酒的清凉感。成冬冬[9]研究发现，添加芫荽籽和陈皮后，比利时小麦啤酒中4-VG的质量浓度可达3.512 mg/L，德国小麦啤酒中4-VG的质量浓度可达3.690 mg/L。

近年来，小麦啤酒日益受到消费者喜爱，为了酿造口感更好的小麦啤酒，势必要不断优化其酿造工艺。上面啤酒酵母WA-04(SaccharomycescerevisiaeWA-04)是一种优良的小麦啤酒酿造酵母，与其他上面啤酒酵母相比，其发酵速度较快，酿造的小麦啤酒醇酯比适中，风味更好，丁香香气更为突出[4]。基于此，本文拟以大麦芽和小麦芽为原料，选用上面啤酒酵母WA-04为发酵菌种，采用单因素试验研究小麦芽添加量、酵母接种量、发酵温度对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响，结合响应面法优化酿造工艺条件；构建上面啤酒酵母合成4-VG的发酵动力学模型，研究上面啤酒酵母合成4-VG过程中菌体与产物之间的动态定量关系，以期更有效地控制小麦啤酒的发酵过程，为适当增强小麦啤酒中的丁香风味提供基础研究数据，为小麦啤酒的工业化酿造提供一定的技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦芽，烟台帝伯仕啤酒技术有限公司产；大麦芽，中粮麦芽(大连)有限公司产；上面啤酒酵母WA-04，保存于大连工业大学菌种保藏中心；4-VG，色谱纯，购于Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要仪器与设备

ZXSD-1270型恒温生化培养箱、ZWYR-D2403型恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司产；CR21 G型超速冷冻离心机，通用医疗集团有限公司产；Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产；FC104型电子天平，上海精科天平有限公司产；BGT-12A型全自动糖化仪，香港赛维斯科技有限公司产；IX73型倒置显微镜，奥林巴斯(深圳)工业有限公司产。

1.3 实验方法

1.3.1 麦汁的制备称取100 g麦芽粉(m(小麦芽)∶m(大麦芽)=9∶11)加入糖化杯，再加入400 mL去离子水后，将糖化杯放入糖化仪进行糖化，于45 ℃保温30 min，以1 ℃/min升温至63 ℃并保温1 h，以1 ℃/min升温至72 ℃并保温10 min，以1 ℃/min升温至78 ℃并保温10 min，糖化结束。过滤麦汁，并用80 ℃去离子水洗糟，收集澄清麦汁。将澄清麦汁于100 ℃条件下煮沸60 min，其间分3次添加体积分数为0.2%的酒花颗粒，煮沸结束后再次过滤麦汁，收集澄清麦汁，并将此次麦汁定型为12oP，备用。

1.3.2 酵母扩培从斜面挑取适量上面啤酒酵母WA-04菌种，接种于50 mL麦汁培养基中，于30 ℃，180 r/min条件下摇床振荡培养48 h后，将其倒入500 mL麦汁培养基中，于20 ℃条件下二次扩培48 h。二次扩培结束后，于8000 r/min条件下离心10 min，收集酵母菌泥用于小麦啤酒的酿造。运用血球计数板计算酵母菌泥的细胞数。

1.3.3 小麦啤酒的酿造工艺量取1 L麦汁加入2 L三角瓶中，于121 ℃条件下灭菌15 min，冷却至20 ℃，接种扩培后的上面啤酒酵母WA-04，于20 ℃恒温培养箱中发酵120 h。

1.3.4 单因素试验研究小麦芽添加量(35%、40%、45%、50%和55%)、酵母接种量(0.5×107CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.5×107CFU/mL、2.0×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL)和发酵温度(16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃和24 ℃)这3个主要影响因素对小麦啤酒(发酵120 h后)中4-VG质量浓度的影响。当单独研究小麦芽添加量时，酵母接种量为1.5×107CFU/mL，发酵温度为20 ℃；当单独研究酵母接种量时，小麦芽添加量为45%，发酵温度为20 ℃；当单独研究发酵温度时，小麦芽添加量为45%，酵母接种量为1.5×107CFU/mL。

1.3.5 响应面试验设计根据以上单因素试验结果，采用全因子中心组合试验设计研究A(小麦芽添加量)、B(酵母接种量)和C(发酵温度)的线性、交互作用和平方效应，取Y(4-VG质量浓度)为响应值，设计17组试验优化酿造工艺条件，表1为响应面试验因素与水平。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 相关指标测定1)生物量：采用干重法测定酵母生物量，小麦啤酒发酵过程中每24 h取样一次，样品于8000 r/min条件下离心10 min，用去离子水清洗1遍后收集菌体，并于105 ℃条件下烘干至恒重。

2)表观浓度：采用密度法测定麦汁表观浓度，样品于8000 r/min条件下离心10 min，取上清液，利用密度瓶测定发酵液密度，换算后即得麦汁表观浓度。

3)4-VG质量浓度：采用高效液相色谱(HPLC)法测定小麦啤酒中4-VG的质量浓度。色谱柱为C18柱(4.6 mm×15 cm×0.45 μm)，柱温为20 ℃，进样量为5.0 μL，流速为0.6 mL/min，紫外分光光度计检测波长为310 nm，流动相为V(水)∶V(甲醇)∶V(磷酸)=64∶5∶1。

1.3.7 发酵动力学模型构建1)酵母细胞生长动力学模型：采用Logistic方程描述酵母细胞生长动力学模型[16]，即

Logistic方程能很好地反映发酵过程中酵母菌体浓度增加对自身生长的抑制作用，其图像是一条典型的S曲线，可以用来拟合发酵过程中酵母的生长。对Logistic方程积分的代数方程为

①

其中，μmax表示最大比生长速率/ (h-1)，X表示生物量/(g·L-1)，X0表示初始生物量/(g·L-1)，Xmax表示最大生物量/(g·L-1)，t表示发酵时间/h。

2)4-VG生成动力学模型：采用Luedeking-Piret方程描述小麦啤酒发酵过程中酵母生成4-VG的过程[17]，即

当t=0，P0=0时，Luedeking-Piret方程可积分为代数方程：

②

其中，P表示4-VG质量浓度/(mg·L-1)，α表示与菌体生长偶联的产物生成参数，β表示与非伴随菌体生长相关的产物合成参数。当α≠0，β=0时，为Ⅰ型偶联关系；当α≠0，β≠0时，为Ⅱ型偶联关系；当α=0，β≠0时，为Ⅲ型偶联关系。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次，结果取平均值。采用软件SPSS 22.0进行数据处理与分析；采用软件Design-Expert 8.0 进行响应面设计与分析；采用软件Origin 9.0进行发酵动力学非线性拟合与绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 小麦芽添加量小麦芽添加量对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响见图1。由图1可知，当小麦芽添加量为35%～45%时，随着小麦芽添加量的增加，小麦啤酒中4-VG的质量浓度逐渐增加，当小麦芽添加量为45%时，4-VG质量浓度最高，达到2.13 mg/L。这是因为小麦芽中的水溶性阿拉伯木聚糖含量高于大麦芽，在麦汁糖化和发酵过程中，可与水溶性阿拉伯木聚糖结合的阿魏酸被大量释放合成4-VG。然而，当小麦芽添加量继续增加时，4-VG的质量浓度开始下降。较高水平的阿魏酸不一定会产生更高水平的4-VG，这可能是因为过量的小麦芽水溶性成分(如酚酸、花青素、单宁等)会抑制酵母脱羧酶的活性，从而降低小麦啤酒中4-VG的质量浓度。因此，选择小麦芽添加量为45%作为后续响应面优化试验的中心点。

图1 小麦芽添加量对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响Fig.1 Effect of wheat malt addition amount on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.1.2 酵母接种量酵母接种量对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响见图2。由图2可知，酵母接种量为0.5×107～1.5×107CFU/mL时，随着酵母接种量的增加，小麦啤酒中4-VG的质量浓度逐渐增加，当接种量为1.5×107CFU/mL时，4-VG质量浓度最高，达到2.15 mg/L。然而，可能是因为阿魏酸含量有限，即使接种量进一步增加，小麦啤酒中4-VG的质量浓度也不会随之再增加。因此，选择酵母接种量为1.5×107CFU/mL作为后续响应面优化试验的中心点。

图2 酵母接种量对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.1.3 发酵温度发酵温度对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响见图3。由图3可知，当发酵温度为16～20 ℃时，随着发酵温度的升高，4-VG质量浓度逐渐增加，当发酵温度为20 ℃时，4-VG质量浓度最高，达到2.16 mg/L。这可能是因为发酵温度的升高导致苯基丙烯酸脱羧酶、酚酸脱羧酶和阿魏酰酯酶在上面啤酒酵母中的活性增加[12]。随着发酵温度的继续升高，4-VG质量浓度略有下降。因此，选择发酵温度为20 ℃作为后续响应面优化试验的中心点。

图3 发酵温度对小麦啤酒中4-VG质量浓度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.2 响应面优化试验结果分析

2.2.1 响应面试验结果与方差分析响应面试验设计与结果见表2。运用Design-Expert 8.0统计软件进行回归拟合，得到如下4-VG质量浓度(Y)的回归方程：

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface test

Y=2.25+0.049A-0.039B+0.010C+

0.012AB-0.040AC-0.005BC-0.29A2-

0.14B2-0.13C2

表3 回归方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应曲面图分析图4所示响应曲面图直观地反映了小麦芽添加量、酵母接种量和发酵温度两两交互作用对4-VG质量浓度的影响，曲面图的曲面坡度越陡峭，等高线越趋近于椭圆，两因素的交互作用越明显[18-19]。由图4可知，各响应曲面图均开口向下，说明在试验选择的取值范围内，存在最佳点可使4-VG质量浓度达到最大值。由图4b)可知，交互项AC响应曲面图呈现规则的山丘状，曲面倾斜程度最大，且等高线呈椭圆形，说明小麦芽添加量和发酵温度交互作用显著，对4-VG质量浓度影响最大。由响应曲面图的曲面坡度可知，AC和AB对4-VG质量浓度的影响均大于BC，A对4-VG质量浓度的影响大于B和C，这与方差分析结果基本一致。

图4 各因素交互作用对小麦啤酒中4-VG质量浓度影响的响应曲面图Fig.4 Response surface plots of the influence of the interaction of various factors on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.3 最佳发酵工艺的确定及验证实验结果分析

综合考虑各因素的交互作用，根据二次多项回归模型优化得到最佳发酵工艺条件为：小麦芽添加量45.91%，酵母接种量1.38×107CFU/mL，发酵温度20.05 ℃，此时，4-VG质量浓度的理论值为2.25 mg/L。为了便于试验操作，将最佳发酵工艺条件修正为小麦芽添加量45.9%，接种量1.4×107CFU/mL，发酵温度20.1 ℃。在该工艺条件下进行小麦啤酒发酵的验证实验，最终得到4-VG质量浓度的实际值为2.30 mg/L，该结果与预测理论值接近，比崔云前[14]在实验室规模的发酵中得到的4-VG质量浓度(2.22 mg/L)略高。该发酵工艺酿造的小麦啤酒酯香浓郁，丁香味突出，具有典型的小麦啤酒香气。

2.4 小麦啤酒发酵过程中相关指标变化分析

在最佳发酵工艺条件下，小麦啤酒发酵过程中的相关指标变化见图5。由图5可知，发酵过程中，酵母生物量逐渐增加，当发酵到96 h时，生物量达到最大值3.76 g/L，此后酵母生长进入稳定期。发酵开始时，4-VG即同时开始合成，且在72 h内快速合成并在啤酒中大量积累。小麦啤酒一般发酵120 h左右，麦汁中的可发酵性糖即已消耗殆尽，酵母生物量不再增加，啤酒发酵结束；此时4-VG仍有少量合成，这可能是因为发酵结束时啤酒酵母中仍具有一定量的活性脱羧酶。

图5 小麦啤酒发酵过程中的相关指标变化Fig.5 Related index in the fermentation process of wheat beer

2.5 发酵动力学模型分析

2.5.1 酵母细胞的生长动力学模型采用Origin 9.0软件对酵母细胞生长曲线试验值按公式①进行非线性拟合，结果见图6。酵母细胞干重(X)随时间变化的函数为

由图6可知，该方程的拟合值与试验值能较好地吻合，模型的R2=0.989，说明Logistic方程可以很好地描述上面啤酒酵母WA-04的生长动力学过程。

图6 酵母细胞生长动力学模型中试验值与拟合值Fig.6 The experimental value and predicted value of yeast growth kinetic model

2.5.24-VG的生成动力学模型式①中，X0=0.89 g/L、Xmax=3.98 g/L、μmax=0.065 1/h，对产物4-VG生成曲线试验值按公式②采用Origin 9.0软件进行非线性拟合，结果见图7。

图7 4-VG生成动力学模型中试验值与拟合值Fig.7 The experimental value and predicted value of 4-VG production kinetic model

4-VG质量浓度(P)随时间的变化函数为

0.16ln[1-0.24(1-e0.065t)]

式中，α=1.22，β=0.002 8。由图7可知，此方程的拟合值与试验值能较好地吻合，模型的R2=0.962，说明Luedeking-Piret方程可以很好地描述小麦啤酒酿造过程中4-VG的生成动力学，可以预测酿造过程中的4-VG产量。但β值远小于α值，几乎等于0，因此，上面啤酒酵母WA-04生成4-VG的动力学模型属于Ⅰ型偶联关系。

3 结论

本文通过小麦啤酒发酵实验，对可能影响4-VG质量浓度的因素进行了实验室小试研究，得到的小麦啤酒最佳酿造工艺条件为小麦芽添加量45.9%，酵母接种量1.4×107CFU/mL，发酵温度20.1 ℃。在此条件下，酿造的小麦啤酒中4-VG的质量浓度最高，为2.30 mg/L。构建的上面啤酒酵母WA-04的生长动力学模型及4-VG的生成动力学模型表明，上面啤酒酵母WA-04生成4-VG的动力学模型属于Ⅰ型偶联关系。后续还需对小麦啤酒进行深入研究，在实验室小试酿造良好的基础上，通过中试试验继续进行放大验证，并对小试酿造确定的工艺条件进行二次检验，为口感醇厚、丁香味适度的高品质小麦啤酒的工业化酿造提供一定的技术参考。