解淀粉芽孢杆菌发酵液的抑菌活性及抗氧化作用

王小娟，任 莉，张铃玉，李洁明，周 波，王惠民,4，苏文金，吴达仁

(1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.中国农业大学资源与环境学院，北京 100193；3.山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271018；4.台湾中兴大学生物医学研究所，台湾 台中 402)

0 引言

黄瓜(CucumissativusL.)在世界各地都有种植[1]。除碳水化合物和膳食纤维外，黄瓜中还含有丰富的维生素和矿物质，具有清热解毒、健脑安神等功效[2]。近年来，黄瓜的种植面积以及集约化种植规模不断扩大，而常年的黄瓜连作种植也导致了土传枯萎病害的泛滥[3]。黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原真菌引起的一种危害性极强的世界性土传病害[4]，黄瓜的整个生长期都有可能感染尖孢镰刀菌。由于尖孢镰刀菌的生命力极强，可存活于土壤长达10 a以上，并随着作物种植时间的增长不断累积，这也导致黄瓜枯萎病成为黄瓜种植过程中难以防治的病害之一。有研究表明，当黄瓜枯萎病严重时，黄瓜减产率高达50%以上甚至绝产，更严重时，就会导致致病土壤不适宜黄瓜栽种[3]，给世界各国的农业生产造成了重大的经济损失[5]。

目前，黄瓜枯萎病的防治手段主要为化学防治、物理防治和生物防治等[6]。这些防治方法对黄瓜枯萎病都具有一定的防治效果，但是每种方法各有优劣。使用化学农药是防治黄瓜枯萎病最常见的方法，且在一定程度上能够快速地抑制黄瓜枯萎病，但其长期施用会导致环境污染，危害人体及牲畜健康[7]，也会导致病原菌耐药性增强，防治效果差[8]。物理防治主要从栽培期间的管理、土壤的杀菌[9]及酸碱处理[10]入手。化学和物理的方法防治效果比较显著，但要及时对植物的根部进行保护，对种植土壤的酸碱性、透气性进行调节，否则极易受品种、天气、土壤以及操作技术等因素的影响而导致该方法无法进行大规模地推广。近年来，人们日益追求蔬菜的品质和食用安全性，绿色、安全、环境友好型的防治方法应运而生。生物防治由于具有无污染、病原菌不易产生抗药性的特点，日益成为国内外研究者的研究热点。生物防治可通过拮抗微生物自身或其次级代谢产物对病原菌产生抑制作用，削弱病原菌的致病力来达到防治的目的[11]。目前，研究天然高效的生物类抗菌物质来防治黄瓜枯萎病已成为食品领域的研究热点之一。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有广谱抗菌的特性，能产生多种具有抑菌作用的次级代谢产物，是研究较多的一类生防细菌[12]。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌的次级代谢产物多为脂肽、多肽、聚酮类和抗菌蛋白质等活性物质，在防治植物病害中起着至关重要的作用，如番茄青枯病[13]、玉米耐盐性[14]、西瓜枯萎病[15]、黄瓜枯萎病[16]、黄瓜灰霉病[17]等。此外，解淀粉芽孢杆菌还能提高植物本身对非生物胁迫的耐受性，如高浓度盐的威胁[14,18]。在种植业中，解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌物质可以作为蔬菜水果的绿色保鲜剂，能够有效地抑制霉菌[19]。在养殖业中，解淀粉芽孢杆菌可作为饲料添加剂，在动物体内调节并保持肠道内的有益菌群的平衡与稳定，从而改善动物的肠道健康[20]，帮助动物消化吸收，提高饲料养分的利用率。此外，解淀粉芽孢杆菌在净化水源、防治水体富营养化等方面也发挥着积极的作用[19]。

本文以解淀粉芽孢杆菌为实验对象，探究其对尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原真菌的拮抗作用，并对解淀粉芽孢杆菌发酵液的最佳发酵条件、理化稳定性进行评价，为后续开发生防菌剂提供理论依据。此外，本实验还探究了解淀粉芽孢杆菌发酵液的抗氧化活性，以期进一步拓宽解淀粉芽孢杆菌发酵液的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

生防菌解淀粉芽孢杆菌SJ100001、病原菌尖孢镰刀菌SJ300024均由山东农业大学资源与环境微生物实验室提供。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基，海博生物有限公司；马铃薯葡萄糖液体(potato dextrose broth,PDB)培养基：马铃薯浸出粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，pH=7.0±0.2；LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，pH=7.0±0.2；NA培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化钠5.0 g，pH=7.3±0.1。

1.1.3 主要试剂

溶菌酶(Lysozyme)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；氢氧化钠、盐酸，西陇化工股份有限公司；胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶，上海麦克林生化科技有限公司；DPPH，Sigma Aldrich；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；ZQZY-AF8型恒温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；Synergy H1MF型多功能酶标仪，BioTek公司；KT-30L型高压蒸汽灭菌锅，日本ALP仪器生产厂家；5810R型高速冷冻离心机，德国艾本德股份有限公司；DK-8D型恒温水浴锅，金坛区金城海澜仪器制造厂；DENVER UB-7型pH计，北京赛多丽丝科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢杆菌SJ100001对尖孢镰刀菌抑菌活性的测定

1.3.1.1 菌种活化

1)病原真菌活化。挑取真菌菌苔，接种到PDA固体培养基中心，28 ℃培养5 d。

2)生防细菌活化。挑取解淀粉芽孢杆菌SJ100001，三区划线法于LB固体培养基划线活化，37 ℃过夜培养。

1.3.1.2 抑菌活性的测定

采用平板对峙法测定抑菌活性，具体过程为：取尖孢镰刀菌菌块(直径为0.7 cm)接种于PDA培养皿(直径为9.0 cm)中心，在菌块两侧1.5 cm处接种解淀粉芽孢杆菌。以尖孢镰刀菌为对照，28 ℃恒温培养，连续观察菌落的生长和生防菌对尖孢镰刀菌的抑制情况。待对照菌株菌丝长满培养皿时测量处理尖孢镰刀菌菌落直径，计算抑菌率[21-22],抑菌率计算公式为：

抑菌率/%=((对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.7))×100。

(1)

1.3.2 解淀粉芽孢杆菌SJ100001抑菌成分来源的测定

1.3.2.1 发酵液的制备

将活化的生防菌挑取1个单菌落接种于50 mL LB培养基中，置于恒温振荡培养箱(37 ℃、180 r/min)发酵12 h，制得发酵种子液。取 1 mL种子液接种于250 mL的LB培养基中，置于恒温培养箱(37 ℃、180 r/min)培养48 h，4 ℃、12 000 r/min下离心10 min去除菌体沉淀，用0.22 μm滤膜过滤，获得无菌滤液备用[23]。

1.3.2.2 菌体胞内可溶物溶液的制备

收集1.3.2.1的菌体沉淀，加入适量生理盐水重悬，4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，重复洗涤2～3次，收集菌体。使用25 mL生理盐水将菌体重悬，得到菌体悬液，向菌体悬液中加入500 μL溶菌酶(100 mg/L)，于37 ℃水浴1 h。然后超声破碎1 h，90 ℃加热处理10 min，4 ℃、12 000 r/min下离心15 min，收集上清液，获得菌体胞内可溶物溶液备用[24]。

1.3.2.3 发酵液和菌体胞内可溶物溶液抑菌活性的测定

参考牛津杯法[25]，并稍作修改。在PDA(直径为9.0 cm)培养皿中心接种尖孢镰刀菌菌块(直径为0.7 cm)，在菌块两侧1.5 cm处放置牛津杯，在牛津杯中缓慢加入200 μL的发酵液或菌体胞内可溶物溶液，以无菌水为对照[26]，28 ℃恒温培养，观察菌落的生长情况。培养72 h后观察发酵液或菌体胞内可溶物溶液对尖孢镰刀菌的抑制效果，计算抑菌率，从而确定活性物质的来源。抑菌率计算参照式(1)。

1.3.3 解淀粉芽孢杆菌SJ100001发酵条件的优化

1.3.3.1 发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响

分别以5%接种量接种种子液于LB、NA和PDB培养基中，恒温振荡(37 ℃、180 r/min)培养48 h，得到LB、NA与PDB的发酵液。分别离心(4 ℃、12000 r/min)15 min，去除菌体沉淀，用0.22 μm滤膜过滤，获得无菌滤液。测定不同培养基发酵液的抑菌活性，计算抑菌率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.3.2 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

以1%接种量接种种子液于PDB培养基中，置于恒温培养箱(37 ℃、180 r/min)，分别培养0，1，2，3，4，5，6，7 d，获得各个时间段的发酵液，并测定抑菌活性，计算抑制率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.3.3 发酵液最佳抑菌时间的测定

采用皿内涂布法[27]测定抑菌活性，具体过程为：PDA培养皿内加入200 μL无菌发酵液并快速涂干，在培养皿的中心放置尖孢镰刀菌块(直径为0.7 cm)，以无菌水为对照组[28]，置于28 ℃恒温培养箱培养，每隔24 h观察测量菌落直径，用十字交叉法测量记录菌落的直径变化。待对照菌株菌丝长满培养皿时停止观察，计算抑菌率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.4 解淀粉芽孢杆菌SJ100001发酵液抑菌活性稳定性

1.3.4.1 pH值对发酵液抑菌活性的影响

取7组洁净的玻璃试管，每组分别加入5 mL的发酵液。实验组用0.2 moL/L的HCl和NaOH分别将发酵液调成pH=2～3，5～6，8～9，10～11，12～13。静置24 h后调回原pH值[29]。对照组pH=7，加入无菌水为溶剂组[28]。参照1.3.1.2的抑菌方法计算抑制率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.4.2 温度对发酵液抑菌活性的影响

取7组洁净的玻璃试管，每组分别加入5 mL的发酵液。实验组分别置于恒温水浴锅或高温高压灭菌锅保持40，60，80，100，121 ℃恒温处理30，60 min。对照组放置室温(25 ℃)，加入无菌水为溶剂组。参照1.3.1.2的抑菌方法计算抑制率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.4.3 蛋白酶对发酵液抑菌活性的影响

取7组洁净的玻璃试管，每组分别加入5 mL的发酵液。实验组分别加入中性蛋白酶(50 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)、酸性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3000 U/mg)、木瓜蛋白酶(200 U/mg)，且使酶的终质量浓度为1 g/L。把各个反应混合液调到其酶最适的pH值与温度，酶解4 h。处理完毕后，将每组置于沸水浴中灭活处理10 min。不加入任何蛋白酶为对照组，加入无菌水为溶剂组。参考1.3.2.3的牛津杯法对峙实验计算抑制率，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.4.4 紫外照射对发酵液抑菌活性的影响

在洁净的石英管中加入5 mL的发酵液，将其置于功率为15 W的紫外灯下分别照射1，2，3，4，24 h。以不做任何处理的发酵液为对照[30]，加入无菌水为溶剂组。参照1.3.1.2的抑菌方法计算抑制率，以考察紫外照射时间对活性物质的影响，抑菌率计算参照式(1)。

1.3.5 解淀粉芽孢杆菌SJ100001发酵液的抗氧化能力测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

准确称取4 mg DPPH溶解在体积分数95%乙醇溶液中，配制成0.1 mmol/L的DPPH工作液。取不同浓度的发酵液100 μL分别加入到100 μL的DPPH工作液中，振荡混匀后避光反应30 min，以Vc(1 g/L)作为阳性对照，在517 nm处测定吸光度值(A1)；空白对照以超纯水代替样品测定吸光度值(A0)；样品对照以体积分数95%乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度值(A2)[31]。DPPH自由基清除率计算公式为：

DPPH自由基清除率/%=(1-(A2-A1)/A0)×100。

(2)

1.3.5.2 铁离子还原能力测定

取100 μL的发酵液与250 μL的0.2 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6.6)、250 μL的质量分数为1%铁氰化钾溶液混合，振荡摇匀，置于50 ℃的恒温水浴锅中水浴30 min。水浴结束后，加入250 μL的质量分数为10%三氯乙酸，将混合物3 000 r/min离心10 min。取250 μL上清液与250 μL的蒸馏水、50 μL质量分数为0.1%三氯化铁混合，避光反应10 min，在700 nm处测定溶液的吸光度值[32]，以Vc(1 g/L)作为阳性对照。

1.3.6 统计学处理

实验所有测定的数据均做3个平行，测定结果以平均值±标准偏差表示，使用SPSS 26.0软件分析并处理数据，P<0.05表示具有统计学差异，采用Graphpad prism 8.0软件进行图像处理。

2 实验结果

2.1 解淀粉芽孢杆菌SJ100001对尖孢镰刀菌的抑菌活性

解淀粉芽孢杆菌SJ100001的抑菌效果如图1、表1所示。在平板对峙实验中，接种解淀粉芽孢杆菌SJ100001的实验组与对照组相比，实验组出现明显透明抑菌带，抑菌率为62.80%，抑菌效果显著，说明解淀粉芽孢杆菌SJ100001可分泌抑制尖孢镰刀菌的物质。

表1 解淀粉芽孢杆菌SJ100001的抑菌结果

2.2 解淀粉芽孢杆菌SJ100001抑菌成分的来源

为进一步探究抑菌活性物质的真正来源，采用牛津杯法检测SJ100001菌体的发酵液和菌株悬液的抑菌活性，结果如图2、表2所示。可见，与对照组相比，菌体悬液组无透明抑菌带出现，尖孢镰刀菌圈呈圆形生长，抑制率仅0.61%；实验组能看到尖孢镰刀菌圈产生明显形变，且抑菌活性达到了38.11%，提示发酵液对尖孢镰刀菌有明显的抑菌作用，且产生抑菌活性的是SJ100001菌株的胞外次级代谢产物。

表2 抑菌活性物质的抑菌活性(72 h)

2.3 解淀粉芽孢杆菌SJ100001的最佳发酵条件

2.3.1 培养基对发酵液抑菌活性的影响

SJ100001菌株在不同培养基中生长，抑菌活性也不同。已有实验表明[33]，培养基中的碳源、氮源和原始的pH值均会对活性物质产生影响。由表3可知，利用NA、LB、PDB 3种培养基分别培养SJ100001菌株，其发酵液中均会产生抑制尖孢镰刀菌的活性物质，但PDB培养基中SJ100001菌株产生的抑菌物质，其抑菌率高于其他2种培养基的。推测PDB培养基培养SJ100001菌株可产生更多的抑菌物质，后期可将其作为发酵培养基，以富集更多活性物质。

表3 不同培养基发酵液的抑菌活性(72 h)

2.3.2 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

SJ100001菌株发酵液的抑菌活性随着发酵时间而变化，结果如图3所示。由图3可见，随着发酵时间的增加，发酵液的抑菌活性先升高后趋于平缓，在第3天时发酵液达到最大抑菌活性59.57%。推测菌株的次级代谢产物在发酵液中随着时间逐渐累积，使发酵液的抑菌活性增强，在发酵3 d达到饱和，抑菌活性不再发生变化。

2.3.3 发酵液最佳抑菌时间

如图4所示，SJ100001菌株发酵液在抑菌实验进行到第2天时，其抑菌效果最佳，抑制率为54.65%。随着抑菌实验的进行，发酵液的抑菌效果降低，在第7天时其抑制率仅26.45%。推测3～4 d后尖孢镰刀菌进入指数生长期，导致后期SJ100001菌株发酵液的抑菌活性相对降低。

2.4 解淀粉芽孢杆菌SJ100001发酵液抑菌活性的稳定性

2.4.1 pH值对发酵液抑菌活性的影响

如图5所示，SJ100001菌株发酵液经不同的酸碱处理后，抑菌活性与对照组相比有显著差异。在pH=2～11时，抑菌活性均在52.00%以上，相比于对照组显著上升(P<0.05)；在pH=12～13时，发酵液的抑菌活性仅0.41%，与对照组相比显著下降了49.69%(P<0.01)。表明发酵液中的抑菌活性物质对酸碱具有一定的耐受性，但在强碱的条件下会失活。

2.4.2 温度对发酵液抑菌活性的影响

如图6所示，发酵液经40，60，80，100，121 ℃分别处理30与60 min后，依然具有较高的抑菌活性，并且活性保持在45%以上，与对照组(25 ℃)相比没有显著差异(P>0.05)。经121 ℃高温高压处理60 min的发酵液，抑菌活性略低于对照组，但仍保持在44%以上。提示发酵液中的活性物质具有较好的热稳定性。

2.4.3 紫外照射对发酵液抑菌活性的影响

如图7所示，经过不同时间的紫外线照射，发酵液的抑菌活性依然保持在30%以上，与未经紫外照射处理的对照组相比没有显著下降(P>0.05)。此外，紫外照射24 h后，发酵液抑菌活性依旧没有显著下降。上述结果表明，SJ100001菌株发酵液的抑菌活性物质具有紫外稳定性。

2.4.4 蛋白酶对发酵液抑菌活性的影响

在不同的蛋白酶酶解处理4 h后，SJ100001菌株发酵液对蛋白酶的稳定性测定结果如图8所示。由图8可见，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶的处理使发酵液的抑菌活性与对照组相比略微降低，但抑制率均在51%；而木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶的处理，相比于对照组的抑菌活性降低至49%左右。

不同蛋白酶特异性酶切位点不同，造成酶解后抑菌活性有差异，但抑菌活性均保持在49%以上，说明发酵液中的活性成分绝大部分没有被蛋白酶破坏，依然具有一定的稳定性。可初步推断，SJ100001菌株产生的具有抑制尖孢镰刀菌的次级代谢产物可能为非蛋白类化合物。

2.5 解淀粉芽孢杆菌SJ100001发酵液的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如图9所示，发酵液的DPPH自由基清除能力与浓度呈正相关，随着浓度的不断提高，发酵液的DPPH自由基清除能力从29.33%上升至87.26%，其抗氧化能力显著提高(P<0.05)，表明发酵液具有一定的抗氧化活性。

2.5.2 铁离子还原力测定

抗氧化物质将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与三氯化铁发生络合反应，形成了蓝色物质，从而在700 nm下有强吸收峰，即抗氧化能力与吸收峰强度呈正比。

如图10所示，铁离子的还原力随着发酵液浓度的增加而增加(P<0.05)，再次证明了发酵液具有抗氧化活性。

3 讨论

已有研究结果显示，解淀粉芽孢杆菌的次级代谢产物如抗菌蛋白[34]、脂肽[35]、多肽类[36-37]等均具有抑菌效果[38-39]。Wong等[40]从解淀粉芽孢杆菌中分离得到相对分子质量为50 ku的抗菌蛋白，该抗菌蛋白通过增加病原菌细胞膜的通透性而起到抑菌效果。Kaewklom等[41]从一株解淀粉芽孢杆菌SP-1-13LM中分离得到一种新型的多肽PPB，该多肽具有广谱抑菌性，可有效抑制包括沙门氏菌在内的多种病原菌的生长。本实验结果表明，解淀粉芽孢杆菌SJ100001的次级代谢产物对尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原真菌具有拮抗作用。

解淀粉芽孢杆菌发酵液抑菌活性受诸多因素的影响，实验表明，SJ100001菌株在PDB培养基中发酵培养72 h时抑菌率最高，且抑菌活性物质在第2 d时抑菌率最高，说明PDB培养基发酵可获得浓度相对较高的抑菌物质，并且仅需较短的时间就达到较好的抑菌效果，有利于后期分离纯化抑菌物质。该培养方法与解淀粉芽孢杆菌H15[42]、解淀粉芽孢杆菌CQN-2[43]和解淀粉芽孢杆菌K6[44]存在一定的差异，这种差异可能与菌株及其来源有关。

次级代谢产物的稳定性影响其提取与开发。夏京津等[45]研究表明，解淀粉芽孢杆菌HE发酵液中的抑菌活性物质对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性。刘昆昂等[46]研究表明，解淀粉芽孢杆菌BA-KA4的胞外抑菌活性物质能够有效抑制灰霉病菌生长，且对温度、pH值和紫外线的稳定性较高。本次实验结果显示，SJ100001发酵液中的抑菌活性物质同样具有良好的耐酸碱性、热稳定性、紫外线以及蛋白酶稳定性。解淀粉芽孢杆菌SJ100001产生的次级代谢产物不仅具有抑菌作用，还具有良好的抗氧化能力。

4 结论

本实验探究解淀粉芽孢杆菌SJ100001对尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原真菌的抑菌作用，结果表明，解淀粉芽孢杆菌SJ100001对尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原真菌具有高效的拮抗作用，且抑菌物质是菌株的次级代谢产物。采用平板对峙法和牛津杯法，确定了SJ100001菌株最佳抑菌效果的发酵条件，即：37 ℃ 180 r/min摇床恒温培养72 h，且通过紫外、温度、酸碱、蛋白酶等稳定性实验和抗氧化活性实验，验证了菌株发酵液具有较好的抑菌稳定性和抗氧化性。