CD4+T 细胞糖酵解在舍格伦综合征中的表达及作用

傅稼耀， 朱晗懿， 李 辉， 石 欢， 王保利， 郑凌艳

（1.上海交通大学医学院附属第九人民医院，口腔医学院口腔外科，国家口腔疾病临床研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院，口腔医学院，上海 200125）

舍格伦综合征（Sjögren’s syndrome, SS）又称干燥综合征，是一种口腔颌面部常见的慢性自身免疫性疾病，其特征为外分泌腺和其他组织免疫系统的自动激活，导致外分泌腺腺体受损，表现为口干和眼干[1-2]。 该疾病可能仅在外分泌腺中发生，或与其他自身免疫疾病一起发生， 例如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）等。SS 的发病率为一般人群的0.5%~1.0%，在所有自身免疫性疾病中发病率相对较高[3]。 SS 患者中，有1/3 患有多种全身性并发症，包括肾、肺或神经功能障碍。 此外，在SS 的晚期，长期异常的免疫激活可能会导致非霍奇金淋巴瘤，这是SS 最严重的并发症[4]。

与其他经典自身免疫性疾病类似，CD4+T 细胞长期以来，一直被认为是主要的淋巴细胞群，其促进了在SS 中能观察到的早期的免疫病理病变[1-2,5]。除了在病变的唾液腺中浸润外，SS 患者的外周血样本还显示出CD4+T 细胞的比例增加。 与正常的外周血淋巴淋巴细胞相比，病变唾液腺组织和外周血中的CD4+T 细胞表现出过度活化的表型[5]。这些活化的CD4+T 细胞具有重要作用，例如调节巨噬细胞功能、帮助B 细胞产生抗体及协调针对病原微生物的免疫反应[6-7]。 一般情况下，当CD4+T 细胞受到外界刺激激活后，会根据周围不同细胞因子[如白细胞介素-2 （interlukin-2, IL-2） 和转化生长因子-β（transforming growth factor-β（TGF-β）等]的浓度，选择性地进入Th1、Th2、Th17、Treg 和Tfh 等细胞亚型， 这些亚型分别起着免疫促进（如Th1、Th17 等细胞亚型）和免疫抑制（如Treg 细胞亚型）的作用[4,6]。 显然，当自身免疫疾病发生时，这些亚型的比例和功能均出现了显著改变。 在SS 患者和SS 样小鼠受损的唾液腺组织中显示Th1/Th2 平衡被破坏，出现大量Th17和Tfh。这些CD4+T 细胞亚群分泌的主要细胞因子，特别是干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-17（IL-17）及其他与T 细胞相关的细胞因子，包括IL-2，与疾病中淋巴细胞浸润的发展有关[8]。 主导或参与CD4+T细胞过度活化并导致SS 发病的分子机制， 一直是一个有争议的话题。

CD4+T 细胞的增殖与活化需要糖酵解参与其中， 糖酵解是后续代谢产物转变为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的重要步骤。 异常的糖酵解会导致自身免疫性疾病的发生和发展，在例如SLE 和类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）等经典自身免疫性疾病中，已观察到CD4+T 细胞中糖酵解水平的上调。 目前也已有一期临床前研究证明，糖酵解抑制剂二甲双胍（metformin）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）可以治疗自身免疫性红斑狼疮[9]。 目前没有关于糖酵解是否影响SS 的报道。 本研究探讨了糖代谢与SS 疾病发展的关系。

1 材料和方法

1.1 动物和组织学测量

本研究挑选了会自发性产生SS 样病变浸润的NOD/ShiLtj（以下称为NOD/Ltj）小鼠作为体内SS 模型， 这类模型鼠在下颌下腺中会产生淋巴细胞浸润，并在8 周龄时出现唾液分泌SS 症状。 对照组小鼠选用同源的野生型ICR 小鼠。 雌性NOD/Lti 小鼠和野生型ICR 小鼠购自南京大学模型动物研究中心，小鼠饲养于SPF 环境。 研究选用糖酵解抑制剂2-DG（Sigma-Aldrich 公司，美国），以饮水喂养（5 mg/mL 2-DG）的方式对各组小鼠进行治疗。 在小鼠8 周龄时对其进行治疗，在治疗2 周和6 周后分别进行观察，并实施安乐死后提取其唾液腺组织。

组织被固定、包埋在石蜡中，用于HE 染色。 使用1968 年Chisholm 和Mason 提出的唾液腺浸润评分系统来评估腺体组织病变的严重程度[10-11]，即一个淋巴病灶被定义为随机4 mm2含50 个淋巴细胞。 简单来说，评分系统：0 为无淋巴细胞浸润，1 为单个视野下少于10 个淋巴细胞的轻度淋巴细胞浸润，2 为中度淋巴细胞浸润但淋巴细胞少于50 个，3 为一个淋巴细胞灶，4 为2 个及以上淋巴细胞灶。 在实验和常规喂养过程中，动物按照美国国立卫生研究院出版的 《实验室动物护理和使用指南》中的标准进行人道关怀[12]。 本动物学研究已通过上海交通大学医学院伦理委员会批准（批准号：SH9H-2021-TK69-1）。

1.2 刺激性唾液流率检测

各组小鼠腹腔注射2.4%戊巴比妥钠（5 mL/kg,Sigma-Aldrich 公司，美国）进行麻醉。 麻醉后根据小鼠体质量注射相应剂量的普鲁卡品 （0.125 mg/kg,Sigma-Aldrich 公司，美国）。 5 min 后，用干棉球收集小鼠唾液10 min，以含唾液棉球的整体质量减去干棉球质量进行换算，收集的唾液根据每只小鼠的体质量进行标准化（25 g）。

1.3 多重荧光免疫组织化学染色

将包埋的腺体组织进行脱蜡和抗原修复处理。首先用分抗CD3（CST 公司，美国）进行一抗孵育，随后用辣根过氧化氢酶偶联化学发光二抗进行二抗孵育。 采用荧光团共轭的酪酰胺信号放大（tyramide signal amplification, TSA） 分子及扩增试剂（PerkinElmer 公司，美国）进行染色和抗体覆盖。 用抗CD4（CST 公司，美国）再次进行一抗孵育，随后的步骤同前。 染色后的结果在荧光显微镜下进行观察。

1.4 外周血CD4+T 细胞分选

按照2002 年欧美SS 诊断共识的标准选择30~60 岁的女性SS 患者17 例，在告知实验内容、签署知情同意书的情况下，在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔外科对患者进行唇腺活检和血样本的采集。 所有患者在采样前均未使用免疫抑制或免疫调节药物。 另外，在知情同意的情况下，随机选取同样年龄区间女性的外周血作为健康人群对照外周血样本。 相关外周血用Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液（GE Healthcare 公司，美国）进行密度梯度离心来分离血液样本中的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），随后用人源性CD4 磁珠（美天旎公司，美国）进行分选。 相关研究方案已获得上海交通大学医学院伦理委员会批准（批准号：SH9H-2019-T159-2）。 在提取完外周血CD4+T 细胞后，立刻提取总RNA，随后进行实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测。

1.5 唾液腺CD4+T 细胞分选

将活检获取的SS 患者唇腺组织浸泡于4 ℃0.9%氯化钠溶液内，30 min 内用无菌剪将其剪成小碎块，并浸泡在Ⅱ型胶原酶中，用gentleMACS 全自动组织处理器（美天旎公司，美国）进行机械消化，消化后的单细胞悬液用Percoll 密度梯度离心法进行初步分层， 纯化淋巴细胞。 随后用人CD4 磁珠（Stemcell 公司，美国）进行阳性分选，在分选后，初步进行计数， 确保细胞数大于1×105个。 一般情况下，1 个患者对应1 个样本， 当存在患者腺体内CD4+T 细胞数量不足时，采用数个患者CD4+T 细胞合并的方式予以补齐。 随后用微量RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，美国）进行提取。

1.6 RT-qPCR 检测

在提取各样本总RNA 后， 用cDNA 逆转录试剂盒（TaKaRa 公司，日本）进行逆转录，随后采用SYBR Green 荧光染液（Roche 公司，瑞士）及引物定制（表1）进行RT-qPCR 检测。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 代谢通量分析

各组小鼠淋巴结和脾组织CD4+T 细胞经研磨后，用鼠源性CD4 磁珠（Stemcell 公司，美国）进行分选。 使用XF96 细胞外代谢分析仪(安捷伦公司，美国) 分析CD4+T 细胞的细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR），即糖酵解速率。 将分选后的CD4+T 细胞进行计数， 随后以每孔2×105个的密度接种在涂有Cell-Tak 细胞黏附剂（Corning 公司，美国） 的Seahorse 96 孔培养板上。 在基础条件下测定含2 nmmol/L 谷氨酰胺的RPMI 1640 培养液的ECAR 值， 同时在实时条件下测定25 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L 寡霉素和50 mmol/L 2-DG 对各组细细胞ECAR 值的实时调控。 本研究选用了7 只10 周龄NOD/Ltj 小鼠和7 只ICR 小鼠进行观察。

对于小鼠的糖酵解速率分析，以添加葡萄糖后的ECAR 值减去添加葡萄糖前的ECAR 值作为该小鼠的糖酵解水平；以添加寡霉素后，尚未添加2-DG 的ECAR 值减去添加2-DG 后的ECAR 值作为该小鼠的糖酵解潜力值。

1.8 数据分析

相关数据使用GraphPad Prism 8.0 软件进行制图及统计学分析。 2 组之前的数值以t 检验进行统计学分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SS 患者浸润CD4+T 细胞中存在糖酵解水平亢进

本研究摘取SS 患者的部分唇腺样本后， 经过HE 染色确认该患者唇腺存在显著的免疫细胞浸润（图1A、B）。 同期，将新鲜样本通过组织研磨和Ⅱ型胶原酶消化的方法获得组织匀浆后，利用MACS 法提取CD4+T 细胞。RT-qPCR 法检测了多个糖酵解节点因子的转录情况， 并将其与健康人群外周血的CD4+T 细胞进行比对。 结果显示，SS 浸润唾液腺组织中糖酵解节点分子己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase M1/2, PKM）的表达（图1C、D）出现显著上升，同时，SS 浸润唾液腺组织和外周血中，CD4+T 细胞糖酵解驱动转录因子MYC 的表达也显著提高（图1E）。 为此，我们初步判定，CD4+T 细胞糖酵解在SS 患者唾液腺浸润组织中，部分糖酵解因子存在转录水平的亢进。

图1 SS 患者CD4+T 细胞糖酵解相关基因表达Figure 1 The expression of CD4+T cell glycolysis-related genes in SS patients

2.2 SS 模型小鼠CD4+T 细胞中糖酵解水平增强

我们随后检测了NOD/Ltj 小鼠和对照组ICR小鼠CD4+T 细胞的ECAR 指标，即2 组细胞的糖酵解水平。 如图2 所示，与ICR 小鼠相比，NOD/Ltj 小鼠的CD4+T 细胞相对表现出的糖酵解能力更高。 该结果进一步证实，SS 发生时，CD4+T 细胞存在异常的糖酵解亢进。

图2 SS 模型鼠的CD4+T 细胞呈现出更高水平的糖酵解Figure 2 Higher level of glycolysis in CD4+T cells of SS mice model

2.3 抑制糖酵解减轻了S S 小鼠的疾病进程

为了明确抑制糖酵解能否有效治疗SS，我们使用糖酵解抑制剂2-DG 处理8 周龄的小鼠。 2-DG 给药后2 周（10 周龄）和6 周（14 周龄）时，对小鼠进行唾液流量检查， 发现2-DG 能有效减缓NOD/Ltj小鼠唾液流率的下降（图3A）。 随后对小鼠下颌下腺最大横截面积切片进行HE 染色， 根据淋巴细胞浸润灶数量进行统计，发现经2-DG 处理后，严重淋巴细胞灶（一个灶内有50 个以上的淋巴细胞）的浸润数量明显下调（图3B）。 同时，单个淋巴细胞浸润灶中的淋巴细胞数量同样明显下调（图3C）。 以上结果表明，抑制糖酵解减弱了SS 的疾病进程。

图3 糖酵解抑制剂2-DG 治疗能有效缓解SS 疾病症状Figure 3 Treatment of 2-DG can effectively attenuate the symptoms of SS

2.4 2-DG 抑制糖酵解可缓解CD4+T 细胞浸润及因子分泌

为了进一步观察CD4+T 细胞的浸润情况，我们用了mIHC 法对总T 细胞（CD3+）进行红色荧光标记， 而对CD4+T 细胞用绿色荧光标记。 如图4A 所示，在NOD/Ltj 小鼠中，CD4+T 细胞是总T 细胞数量的主要成分， 这与先前研究对CD4+T 细胞在SS 疾病中的认知相一致。 而经2-DG 处理后， 我们发现CD4+T 细胞的数量显著减少。 进一步对小鼠唾液腺进行消化，获取单细胞匀浆，观察CD4+T 细胞效应分化（尤其是Th1 细胞和Th17 细胞）相关基因转录情 况。 RT-qPCR 示，Th1 细 胞 相 关 指 标IFN-γ 和Th17 细胞相关指标IL-17 的基因水平在NOD/Ltj 小鼠唾液腺内的表达显著上调，而采用2-DG 处理后，IFN-γ 与IL-17 的表达均有所下调，其中以IL-17 下调幅度更为明显（图4B）。 因此，我们确定抑制糖酵解可以通过降低浸润CD4+T 细胞的数量和效应分化来减缓疾病的进展。

图4 糖酵解抑制剂2-DG 能有效抑制CD4+T 细胞浸润Figure 4 Treatment of 2-DG can effectively inhibit the infiltration of CD4+T cell

3 讨论

CD4+T 细胞的过度激活是SLE、SS 等自身免疫性疾病的共同标志。 在激活后， 周期静止的初始T细胞迅速进行大量克隆扩增，以支持其分化为T 细胞亚群和分泌细胞因子。 活化的CD4+T 细胞可协调自身免疫反应，如调节巨噬细胞功能，促进B 细胞成熟、定位和抗体的产生[6-7]。 因此，在SS 等自身免疫性疾病的病理过程中， 活化的T 细胞与静止的T细胞相比，细胞增殖增加，代谢需求也有所不同。 活化的T 细胞需在短时间内产生大量ATP，这一过程主要由代谢途径的改变所支持。 Sharabi 等[13]对免疫细胞代谢的重要性进行排序， 他们认为糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢是T 细胞的主要代谢方式，且在CD4+T 细胞不同亚型中， 细胞的主要代谢手段也有所差异。 在介导自身免疫疾病的Th1 和Th17 细胞亚型中，多数研究者认为，糖代谢（尤其是糖酵解）是支持其效应分化和因子分泌的主要代谢手段。在CD4+T 细胞激活后，存在糖代谢方式从氧化磷酸化向有氧糖酵解转变，这一改变也被称为“Warburg效应”[14-15]。 增强的糖酵解支持对葡萄糖摄取和使用的依赖性增加[16]。许多研究表明，抑制葡萄糖摄取可以显著抑制T 细胞的增殖和细胞因子的产生[17-18]。同样，也有人提出抑制CD4+T 细胞的葡萄糖代谢可以延缓SLE[9,19-20]，RA[21-22]和自身免疫性脑脊髓炎[19]的进展。本研究中，我们初步证明了采用2-DG 抑制糖酵解可以减少浸润CD4+T 细胞的数量， 减缓SS的进展。 这一结果提示靶向CD4+T 细胞糖酵解可能为防止SS 和其他自身免疫性疾病的全新手段。

目前， 靶向糖酵解的关键蛋白有PKM2、HK2、GLUT1、PDHK 等，这些蛋白也在许多研究中被证实可以缓解自身免疫疾病。 其中，Koga 等[23]发现靶向与GLUT1 可有效抑制糖摄取和钙离子内流， 缓解SLE。 Damasecno 等[24]利用PKM2 的小干扰RNA 和抑制剂， 发现该分子能同时缓解糖酵解和炎症反馈。 而目前最常用、最公认的糖酵解抑制剂依然是本研究中所采用的2-DG。 该抑制剂是一种葡萄糖类似物，同样被细胞膜表面葡萄糖转运受体蛋白所识别，并转运至细胞中，竞争性地被己糖激酶磷酸化，但不能被代谢并积累在细胞中，从而阻断糖酵解途径，导致ATP 耗竭[25]。 目前，该药物已经初步应用于抗病毒、抗免疫、抗肿瘤治疗的临床前期研究中[26]。 本研究采用2-DG 对SS 模型鼠进行治疗，确认其能抑制CD4+T 细胞的异常糖代谢亢进，从而减弱CD4+T 细胞异常浸润及功能发挥。 但在后续的研究中，我们依旧需要明确其潜在的副作用，以进一步支持该药物的后续临床靶向研发。

综上所述，我们的研究表明， SS 患者及相关模型动物的CD4+T 细胞中存在一定水平的糖酵解亢进。采用糖酵解抑制剂2-DG 对SS 模式动物进行治疗可以减弱CD4+T 细胞的异常浸润和因子表达，缓解SS 样自身免疫反应。