Circ_0000502 靶向调节miR-1231 促进口腔鳞状细胞癌HSC-3 细胞增殖和抑制细胞凋亡的体外研究

马素伟， 张 娟， 杨 晋， 靳 昊， 王 焱， 高 杰

（保定市第二中心医院，河北 保定 072750）

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，约占头颈部恶性肿瘤的20%。 近年来，手术、放疗、化疗等治疗策略取得一定进展，但OSCC的高侵袭性、转移性、复发性影响了治疗效果[1]。 据统计，OSCC 患者5 年生存率仅为50%，其中肿瘤细胞的异常增殖和凋亡是OSCC 患者预后不良的主要原因[2]。然而，OSCC 进展的潜在机制并不十分清楚。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一大类内源性以共价闭合环为特征的RNA，在包括人类在内的多个物种中普遍表达。研究显示，circRNA 作为分子海绵与微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，或者作为RNA 结合蛋白等多种机制参与调节基因的表达、转录、翻译，进而发挥其生物学作用[3]。 研究表明，骨肉瘤中circ_0000502 表达增加具有显著的促增殖、迁移侵袭和抗凋亡作用[4]。 在肝癌中，抑制circ_0000502 表达能显著降低肝癌细胞的恶性增殖、迁移和侵袭能力，具有癌症治疗靶点的潜力[5]。miR-1231 是一种胶质瘤、前列腺癌抑癌基因，其表达减少或缺失在胶质瘤、前列腺癌的恶性进展中起关键作用[6-7]。 序列分析发现，circ_0000502 与miR-1231 存 在 潜 在 相 互 作 用。 但circ_0000502、miR-1231 在OSCC 进展中的作用，circ_0000502 是否靶向miR-1231 参与OSCC 进展尚未有研究。本研究重点分析了circ_0000502、miR-1231 表达对OSCC 细胞增殖、凋亡以及增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白Bcl-2 和Bax 表达的影响， 明确了circ_0000502对miR-1231 的调控作用，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织样本 选取2016 年2 月—2018 年2 月于我院进行手术的43 对OSCC 组织和配对癌旁组织 （邻近正常组织）。 所有患者术前均未接受放化疗。 该研究方案经我院医学伦理委员会批准（批准号：201600032），并获得所有患者的书面知情同意。

1.1.2 细胞和主要试剂 人OSCC 细胞HSC-3（中国典型培养物保藏中心， 中国）；Bulge-Loop miRNA RT-qPCR 试剂盒、逆转录酶（广州锐博生物公司，中国）；Prime Script RT Reagent 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ（大连TaKaRa 公司，中国）；小干扰RNA（si-RNA）、过表达质粒（pcDNA-RNA）、miRNA 模拟物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）、双荧光素酶报告载体（上海生工公司，中国）；膜联蛋白（Annexin V）-异 硫 氰 酸 荧 光 素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物，中国）； MTT细胞增殖检测试剂盒、兔抗Ki-67 抗体、兔抗B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2 抗体、兔抗Bcl 相关X 蛋白（Bcl associated X protein，Bax）抗体、GAPDH 抗体、羊抗兔IgG 二抗（上海艾博抗生物公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 实时定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 分析circ_0000502 和miR-1231 的表达 使用TRIzol 试剂从OSCC 组织和配对的癌旁组织中分离总RNA。逆转录酶合成cDNA 后， 利用Bulge-Loop miRNA RT-qPCR 试剂盒分析 miR-1231 表达水平。circ_0000502 检 测 采 用Prime Script RT Reagent 试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ进行。 2-ΔΔCt法分析circ_0000502 和 miR-1231 的相对表达量。circ_0000502 上游引物5′-ACAAUAUCAAAAGAGGAAAG-3′， 下游引物5′-AAAGGAAGUGGGUAGGAGGAAAG-3′ ； 内 参GAPDH 上 游 引 物 5′ -CGCTCTCTGCTC CTCCTGTTC-3′， 下 游 引 物5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-1231 上 游引物5′-G CCAGTGTCTGGGCGGAC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′； 内参U6 上游引物5′-ATGGCTATAAATAGATACACGC-3′， 下游引物5′-GGTACAAACAGGGAGGGA-3′。

1.2.2 转染和实验分组 HSC-3 细胞采用DMEM培养液进行常规培养， 细胞80%融合时胰酶消化后按照1∶3 的比例接种新的培养瓶， 换液频率为每周3 次。 将第3 代对数期HSC-3 细胞接种到6 孔板中，利用Lipofectamine 2000 将si-NC、si-circ_0000502、miR-NC、miR-1231 mimics、si-circ_0000502+anti-miR-NC、si-circ_0000502+anti-miR-1231 mimics 分别转染50%融合的HSC-3 细胞，依次命名为si-NC 组、si-circ_0000502 组、miR-NC 组、miR-1231 组、si-circ_0000502+anti-miR-NC 组、sicirc_0000502+anti-miR-1231 组。 无血清培养液孵育6 h 后更换为新鲜完全培养液培养。 转染48 h 时收获细胞测定转染效果，进行后续功能实验。

1.2.3 MTT 实 验 检 测 增 殖 将 各 组HSC-3 细 胞（1×104个/孔） 接种于96 孔板中， 培养48 h 后取20 μL 的MTT 试剂添加到每孔中，继续培养2 h。在振荡器上短暂振荡后， 用酶标仪检测490 nm 波长处各孔吸光度值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组HSC-3细胞，按照1×107个/mL 的浓度重悬于Annexin V 结合缓冲液中。 向100 μL 细胞悬液中加入5 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的PI 染色。 室温避光孵育15 min 后，将细胞悬液与400 μL Annexin V 结合缓冲液混合。 流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.5 蛋白质印迹法(Western blotting)分析Ki-67、Bcl-2 和Bax 蛋白表达 用RIPA 缓冲液从各组细胞中提取总蛋白， 并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒浓度。 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30 μg 蛋白样品， 然后进行湿法转膜。1%牛血清白蛋白缓冲液封闭膜后，用一抗4 ℃下孵育过夜，再与二抗偶联物温室温下孵育1 h。 显影定影后， 用Quantum One 软件分析条带灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH 灰度值比值表示对应蛋白表达量。

1.2.6 双荧光素酶报告实验 利用Lipofectamine 2000 将含有miR-31 靶向位点的野生型（wild type，WT）circ_0000502 报告载体 （WT-circ_0000502）或miR-31 靶向位点突变的突变型（mutant type，MUT）circ_0000502 报 告 载 体（MUT-circ_0000502），分 别与miR-1231 mimics、miR-NC 共转染HSC-3 细胞。收获转染48 h 的细胞，采用双重荧光素酶报告试剂盒检测相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

所有实验独立重复3 次，每次设置3 个平行实验。采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。所有的数据均符合正态性，采用均数±标准差（±s）表示。 采用t 检验比较2 组间差异， 采用单因素方差分析和SNK-q 检验进行多重比较。 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ_0000502 和miR-1231 在OSCC 组织中的表达

Circ_0000502 在OSCC 组织中的相对表达量较癌旁组织高（P<0.05），而miR-1231 在OSCC 组织中的相对表达量较癌旁组织低（P<0.05）。详见表1。癌旁组织和OSCC 组织病理图片见图1。

表1 Circ_0000502 和miR-1231 在OSCC 组织中的相对表达量Table 1 The relative expression levels of circ_0000502 and miR-1231 in OSCC tissues

图1 癌旁组织和OSCC 组织病理图片(×100)Figure 1 Histopathological features of OSCC and OSCC adjacent tissues (×100)

2.2 抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞增殖的影响

与si-NC 组 比 较，si-circ_0000502 组HSC-3 细胞circ_0000502 表达量降低， 细胞活力和Ki-67 蛋白表达量降低（P<0.05）。 见表2 和图2。

表2 抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞增殖的影响Table 2 Effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation of HSC-3 cells

图2 Ki-67 蛋白表达Figure 2 Expression of Ki-67 protein

2.3 抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞凋亡的影响

与si-NC 组 比 较，si-circ_0000502 组HSC-3 细胞Bax 蛋白表达量、凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表达量降低（P<0.05）。 详见表3 和图3。

图3 抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of circ_0000502 inhibition on the apoptosis of HSC-3 cells

表3 抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞凋亡的影响Table 3 Effect of inhibiting circ_0000502 on the apoptosis of HSC-3 cells

2.4 Circ_0000502 靶向调控miR-1231 的表达

Circular RNA interactome 在线分析显示，circ_0000502 与miR-1231 之间存在互补结合位点，见图4。 miR-1231 mimics 和WT-circ_0000502 共转染与miR-NC 和WT-circ_0000502 共转染比较，细胞相对荧光素酶活性降低 （P<0.05）； 而miR-1231 mimics 和MUT-circ_0000502 共转染与miR-NC 和MUT-circ_0000502 共转染比较，细胞相对荧光素酶活性无显著变化， 见表4。 pcDNA-circ_0000502 组HSC-3 细胞中miR-1231 的表达较pcDNA 组显著降低（P<0.05），而si-circ_0000502 组HSC-3 细 胞 中miR-1231 的表达较si-NC 组升高（P<0.05），见表5。

图4 Circ_0000502 的序列中含有与miR-1231 互补的核苷酸序列Figure 4 The sequence of circ_0000502 contains a nucleotide sequence complementary to miR-1231

表4 双荧光素酶报告实验Table 4 Double luciferase reporter assay

表5 Circ_0000502 调控miR-1231 的表达Table 5 Circ_0000502 regulates the expression of miR-1231

2.5 miR-1231 过表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的影响

与miR-NC 组比较，miR-1231 组HSC-3 细胞miR-1231 表达量、Bax 蛋白表达量、 细胞凋亡率升高， 细胞活力、Ki-67 蛋白表达量和Bcl-2 蛋白表达量降低（P<0.05）。 详见表6 和图5。

图5 miR-1231 过表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的影响Figure 5 Effects of overexpressing miR-1231 on proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

表6 miR-1231 过表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的影响Table 6 Effects of overexpressing miR-1231 on proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

2.6 抑制miR-1231 表达逆转了抑制circ_0000502表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的作用

与si-circ_0000502+anti-miR-NC 组 比 较，sicirc_0000502+anti-miR-1231 组HSC-3 细 胞miR-1231 表达量、Bax 蛋白表达量、细胞凋亡率降低，细胞活力、Ki-67 蛋白表达量和Bcl-2 蛋白表达量升高（P<0.05）。 详见表7 和图6。

图6 抑制miR-1231 表达逆转了抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的作用Figure 6 Inhibiting the expression of miR-1231 reversed the effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

表7 抑制miR-1231 表达逆转了抑制circ_0000502 表达对HSC-3 细胞增殖和凋亡的作用Table 7 Inhibiting the expression of miR-1231 reversed the effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

3 讨论

OSCC 发生、 发展是由遗传和表观遗传变化累积驱动的多步骤过程。 在这些风险因素中，多种circRNA 已被广泛研究且被确定为OSCC 的致癌或抑癌基因。 例如，Ouyang 等[8]报道，circ_0109291高表达促进了OSCC 细胞增殖和迁移，circ_0109291表达水平越高，OSCC 患者预后越差。 Peng 等[9]证实circRNA_0000140 通过靶向miR-31 抑制Hippo信号通路和OSCC 的生长和转移。 因此，阐明circRNA 在OSCC 进展中的作用可为OSCC 患者提供有价值的治疗靶标。 本研究结果显示，circ_0000502在OSCC 组织中的表达明显高于癌旁正常组织。 为进一步阐明circ_0000502 在OSCC 组织中的生物学功能，我们发现，抑制circ_0000502 表达显著抑制了OSCC 细胞HSC-3 的活力， 而增强了细胞凋亡。Ki-67 作为核蛋白，与肿瘤增殖呈正相关关系，研究指出，OSCC 组织中Ki-67 的表达高于其在肺肿瘤组织中， 且随着口腔黏膜组织的异常增生而增加，与OSCC 患者总生存期、无转移生存期、无复发生存期呈负相关，是OSCC 患者的独立预后因素[10-11]。 Bcl-2家族蛋白介导的线粒体途径是诱导凋亡的重要信号通路，Bcl-2 是强抗凋亡蛋白，Bax 是细胞凋亡的诱导剂，Bax 存在线粒体外膜，其通过促进细胞色素C 的释放触发一系列caspase 活化来诱导细胞凋亡[12]。 本研究中，抑制circ_0000502 表达显著降低了Ki-67 和Bcl-2 水 平， 升 高 了Bax 水 平， 与 抑 制circ_0000502 表达的抗增殖、促凋亡作用一致。以上研究表明，circ_0000502 在OSCC 中具有致癌作用。

miRNA 海绵作用是circRNA 最广泛研究的功能之一。研究显示，circ_100290 通过与miR-378a 结合降低了miR-378a 对葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的抑制作用，从而促进了OSCC细胞中的糖酵解和增殖[13]。Circ_0001971 通过靶向miR-194/miR-204 在体外和体内调节OSCC 的进展和化疗敏感性[14]。 本研究发现，circ_0000502 存在miR-1231 的结合位点。miR-1231 是癌症中变化最频繁的miRNA 之一，在胶质瘤[15]、甲状腺乳头状癌[16]等一系列肿瘤类型中检测到miR-1231 表达降低。Circ_0025033 通过抑制miR-1231 增强了甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制细胞的凋亡[16]。此外，circ-DCAF6 通过降低miR-1231 水平促进了胃癌细胞的生长和侵袭[17]。 本研究显示，OSCC 组织中miR-1231 表达降低， 体外实验显示，过表达miR-1231 能显著降低HSC-3 细胞活力，提高细胞凋亡率，抑制Ki-67 和Bcl-2 表达，促进Bax表达。同时本研究还发现，circ_0000502 与miR-1231直接结合，且负向调控miR-1231 表达。 此外，抑制miR-1231 表达还可抵消circ_0000502 抑制对HSC-3 细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，并相应改变Ki-67、Bcl-2 和Bax 蛋白的表达水平。 以上研究证实，circ_0000502/miR-1231 分子轴参与调控OSCC 细胞的增殖和凋亡，进而在OSCC 进展中具有重要作用。 然而，本研究仍存在不足之处，如circ_0000502下游是否存在其他miRNA、miR-1231 的下游靶基因，仍需进一步验证。

综上所述，circ_0000502 在OSCC 中呈高表达，miR-1231 呈低表达。抑制circ_0000502 通过靶向负调控miR-1231 可抑制OSCC 细胞HSC-3 增殖并诱导其凋亡。这基本揭示了circ_0000502/miR-1231 分子轴在OSCC 进展中的作用， 提示circ_0000502 和miR-1231 是OSCC 的潜在靶点， 靶向抑制circ_0000502/miR-1231 分子轴可能是遏制OSCC 进展的重要策略。