实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌耐药性的价值观察

张 三 唐姗姗

1.新郑市人民医院科检验科 (河南 新郑 451100)

2.新郑市城关乡卫生院检验科 (河南 新郑 451100)

结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染可引发结核病，对患者生命安全构成严重威胁。近年来，结核病发病率逐年上升，小部分结核病患者病情进展为利福平耐药结核，而大部分患者发展为多重耐药结核，给治疗增加难度[1]。现阶段，临床对于MTB的检测主要依靠药物敏感度试验及结核菌培养等，虽该方法准确性好且操作成本较低，但培养周期较长，在此期间内易延误患者最佳治疗时机[2]。随着医疗技术的快速发展，实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法在临床上的应用具有检测速度快、检查成本低等特点，可为临床诊断MTB耐药提供可靠依据[3]。鉴于此，本研究采用实施荧光定量PCR法分析MTB耐药性，旨在探究其临床应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年10月至2020年11月我院收治的结核病患者84例，均符合《肺结核诊断和治疗指南》[4]中疾病相关诊断标准，本研究获伦理委员会批准。其中男45例，女39例；年龄19～69岁，平均年龄(44.58±3.61)岁。

1.2 方法(1)核酸提取：将80L核酸提取液加入核酸提取试管中，刮取少量菌落转移至试管中，在核酸快速提取仪下振荡10min，并将其置于95℃金属浴内10min，随后取出并离心处理1min获得核酸，用于扩增操作。(2)检测准备及原理：对利福平、链霉素、异烟肼、阿米卡星、乙胺丁醇、莫西沙星等药物的耐药状况进行分析。按照待检测样本数量的5倍，准备200L平盖PCR薄壁管，分别从试剂盒中提取扩增反应液A/B/C/D/E，彻底融化后漩涡震荡。按照每管25L分装各扩增反应液至PCR薄壁管中，随后将其转移至PCR模板加样区。向每个样品中加入同一模板DNA 5L，保证每管总体积为30L。(3)PCR扩增及结果的判断：将PCR反应管置于荧光PCR仪中，行扩增操作，检测结果由MTB耐药基因检测分析系统进行辅助的判读。

1.3 观察指标以罗氏药敏比例法作为检测MTB耐药性的“金标准”，分析FQ-PCR法在MTB耐药性中的应用价值，包括灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值。以n表示总例数，a表示真阳性，b表示假阳性，c表示假阴性，d表示真阴性。灵敏度=a/(a+c)，特异度=d/(b+d)，准确度=(a+d)/n，阳性预测值=a/(a+b)，阴性预测值=d/(c+d)。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件处理数据，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，FQ-PCR法诊断MTB耐药性与罗氏药敏比例法检查结果的一致性使用kappa检验，kappa值≥0.75表示一致性良好，0.4～0.74表示一致性尚可，＜0.4表示一致性不佳；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

FQ-PCR法分析MTB耐药性中各药物灵敏度、特异度、阳性预测值比较差异有统计学意义(P＜0.05)；而准确度及阴性预测值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。kappa检验显示：对阿米卡星检测一致性不佳(kappa值为0.279)；对利福平、异烟肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分别为0.637、0.631、0.578、0.623)；对链霉素一致性良好(kappa值为0.815)。

表1 FQ-PCR法在MTB耐药性分析中的应用价值

3 讨 论

现阶段，临床对于结核病的治疗主要采用药物的方式，通常采用一线及二线抗痨药物联合使用，其中一线抗痨药物包括利福平、链霉素、乙胺丁醇、异烟肼，可取得一定的效果，安全性高[5-6]。而二线抗痨药物包括氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素类药物，但单纯用药存在较高的风险，加之不规则的错误的化疗，使得药物耐药性大大上升，患者治疗依从性明显下降[7-8]。故对上述抗结核药物耐药性行积极的管理有助于更好的给出治疗方案指导临床治疗。

既往传统培养法在药敏结果检测中耗时较长，易延误患者治疗时机。近年来，分子诊断技术在MTB耐药检测中得到广泛应用，MTB耐药的产生是因自身基因突变而导致[9]。因此，对某些基因片段发生突变在耐药菌株中占较大比例时，可通过对基因片段进行检测判断该菌株的耐药情况。本研究结果显示，FQ-PCR法分析MTB耐药性中各药物灵敏度、特异度、阳性预测值比较差异有统计学意义，而准确度及阴性预测值比较差异无统计学意义。kappa检验显示：对阿米卡星检测一致性不佳(kappa值为0.279)；对利福平、异烟肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分别为0.637、0.631、0.578、0.623)；对链霉素一致性良好(kappa值为0.815)，提示FQ-PCR法在MTB耐药性诊断中应用价值较高，能够检出MTB对药物的耐药性，且一致性较强。究其原因可知FQ-PCR法具有检测时间短、成本低、药物检测种类多等优势，能够有效避免PCR污染等导致检测结果差异等问题。本研究中FQ-PCR法对阿米卡星耐药性检出一致性不佳，较好说明该基因型检测位点的耐药监测准确性不高，或存在其他的耐药基因位点的突变。另该方法对其他药物耐药性检测虽灵敏度不高，或存在耐药表型与基因型存在差异，可能与MTB表型耐药不稳定而发生改变相关，亦或与部分突变为无意义突变等不会对MTB耐药性造成影响[10]。

综上所述，实施荧光定量PCR法在MTB耐药性检测中应用价值较高，具有较好的应用前景，可为临床用药提供指导，值得推广。