獭兔肠乳杆菌的分离鉴定

黄婧文，李欢，周亚南，区海蕴，吴晨晓，梁润利，肖芬，朱芝秀

（江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045）

肠乳杆菌是指一类从肠道分离得到，能利用葡萄糖或乳糖产生大量乳酸的细菌，其革兰氏染色呈阳性，无芽孢，不运动，是一类常见益生菌[1]。目前，益生菌常用于畜牧养殖业，对抑制病原菌、刺激胃肠道蠕动、提高机体消化吸收能力、提高机体免疫力具有一定作用[2]。动物饲养过程中，抗生素滥用现象屡禁不止，但随着人们对动物食品品质要求的提高，监管部门及市场对安全、高效、无毒的生物制剂的要求也越来越高[3]，根据农业农村部公告第194号文件要求，从2020年7月1日起，我国开始全面禁用饲用抗生素。2020年9月27日国务院办公厅印发的《关于促进畜牧业高质量发展的意见》（国办发[2020]31号），明确提出“持续推动畜牧业绿色循环发展”，要求严格执行饲料添加剂安全使用规范，加强兽用抗菌药综合治理，实施动物源细菌耐药性监测、药物饲料添加剂退出和兽用抗菌药使用减量化行动。从长远角度看，禁用抗生素是畜禽、水产养殖业迈向绿色、可持续发展的重要里程碑，无抗养殖方法，代表了健康养殖的发展方向，也是今后发展的必然方向。但短期内，替抗药物的发展还未成熟，禁抗令的实施，可能导致诸多行业问题[4]。因此，在如今“禁抗”的背景趋势下，研发应用绿色、高效、健康的抗生素替代品，缩短“替抗”的过渡时间是当前养殖领域中迫切需要解决的问题，益生菌应用于畜禽生产已成必然趋势[5]。獭兔作为一种皮肉兼用的小型食草动物，具有较高的经济价值，然而还鲜见獭兔源益生菌的筛选应用[6]。本试验从健康獭兔十二指肠道中分离乳酸菌，并进行鉴定，得到7株能稳定产酸的优势菌株，旨在探索合理高效的分离方法，并为后续开发有利于生产的益生菌制剂提供潜在菌株，以期在临床上减少或替代抗生素使用，为开发适用于獭兔生产的乳酸菌制剂提供理论和试验基础，促进我国养殖业绿色可持续发展。

1 材料

1.1 试验动物

健康獭兔2只，2～3kg/只，购自南昌某兔场。

1.2 主要试剂及仪器

革兰氏染色液：自制；MRS改良培养基、MRS肉汤：购自北京奥博星生物技术有限责任公司；微量发酵管：购自杭州天和微生物有限公司。

2 方法

2.1 样品采集

从兔场中随机挑选健康且精神状态佳的獭兔，麻醉处死后以0.1%新洁尔灭消毒液浸泡消毒30min，然后使用一次性无菌手术刀沿腹中线打开腹腔，截取其十二指肠，立即使用生理盐水灌洗所截取肠道，直至灌洗水清澈后剪开肠道，用灭菌药匙分别刮取0.5g肠黏膜，加入5mL生理盐水中，充分摇匀，即得到初始样品。

2.2 细菌分离培养

用移液枪分别吸取100uL样品置于5mL MRS肉汤中，37℃培养48h，用无菌棉签蘸取培养液，均匀涂布于MRS改良培养基，37℃培养24h后，选取溶钙圈明显且形态一致、大小相等、半透明的单个圆形菌落于MRS培养基上反复纯化，直至得到单一一致菌落，分别命名为T-C-4,T-C-6,T-C-8,T-C-10,T-C-12,T-C-14,T-C-16。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 细菌初筛。对分离菌进行革兰氏染色镜检，观察其形态、大小、有无芽孢等形态学特征并记录。

2.3.2 细菌生化鉴定。挑取MRS培养基上过夜培养的单个菌落，依照说明书分别接种于过氧化氢酶、蛋白胨水、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、七叶苷、菊糖、棉子糖、山梨糖、阿拉伯糖、枸橼酸盐、尿素、硫化氢、木糖、松三糖、纤维二塘、MR/VP等微量发酵管中，37℃恒温培养，滴加试剂，观察并对照《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《乳酸菌分类鉴定及试验方法》[8]，初步确定细菌种属。

2.3.3 16sRNA鉴定。挑取分离菌单个菌落于MRS液体培养基中，37℃振荡培养48 h，进行变性处理后，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，利用16S r DNA通用测序引物16S-F:5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′，16S-R:5′-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR扩增[8]。PCR扩增程序如下：于95℃预变性5 min;95℃变性45 s,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃再延伸8 min。取PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果并拍照。将PCR扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,测序结果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLAST工具在线比对,通过Megalign和MEGA 7.0软件分别进行同源性和系统进化树分析,确定菌种名。

3 结果

3.1 分离筛选结果

T-C-4、T-C-6、T-C-8、T-C-10、T-C-12、T-C-14、T-C-16菌落在MRS改良培养基上均呈现明显溶钙圈，菌落大小中等、颜色灰白、半透明，边缘整齐、光滑湿润，见图1。革兰氏染色结果见图2，显示为G+杆菌，未发现芽孢。

图1 分离菌培养菌落

图2 分离菌G染色结果

3.2 细菌生化试验结果

结果见表1，经对照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸菌分类鉴定及试验方法》后，初步得出T-C-4、T-C-6、T-C-8、T-C-10、T-C-12、T-C-14、T-C-16均为肠乳杆菌。

表1 生化试验结果

3.3 16sRNA分子鉴定结果

3.3.1 分离菌PCR扩增电泳结果。结果见图3，PCR产物在15 g/L琼脂凝胶上的电泳，在1500 bp出现单一明亮的目的片段，且未发现杂带。

图3 分离菌电泳图

3.3.2 同源性比对。扩增后的PCR产物送至湖南擎科生物技术有限公司测序，将测序结果在NCBI数据库比对，经比对可知分离菌与唾液乳酸杆菌同源性最高（图4）。

图4 分离菌同源性比对结果

3.3.3 系统发育树构建。从Gen Bank中挑选23株乳酸杆菌属菌株，利用MEGA7.0软件的Clustal W算法进行多序列比对与系统发育树的构建，结果见图4。其 中T-C-6、T-C8、T-C-12、T-C-16与 菌 株NR112759.1、AB326353.1、AF089108.2亲缘关系最近，与菌株MR041457.1、LC589224.1亲缘关系最远（图5）。

图5 分离菌系统发育树

4 讨论分析

本次试验分离得到7株乳酸菌。经过革兰氏染色镜检，生化特性初步鉴定，结果与乳杆菌高度相似，经16sRNA分子生物学鉴定，同源性比对和进化树构建，确定分离菌均为唾液乳酸杆菌（Lactobacillus salivarius strain），说明唾液乳杆菌是獭兔十二指肠中稳定存在的一种优势菌落，与曾博报道的结果相符合[9]，为研究獭兔肠道微生态提供了理论依据。

在生化试验中，分离菌吲哚试验为阴性，与蒋磊的报道相同[10]，硝酸盐还原反应、硫化氢试验均为阴性，不能分解尿素；大部分分解甘露醇、蔗糖，与刘小兰报道的菌种相符[11]，均分解菊糖、棉子糖、山梨糖，少数分解麦芽糖、乳糖，均不分解阿拉伯糖、木糖、松三糖、纤维二糖，与桑梦琪、赵艺竹、张海威等报道的分离菌不符[12～14]，部分分离菌可分解的糖类有差异，这些可能与菌株个体差异有关。

在獭兔养殖中，饲料改变、气候变化、过量使用抗生素类药等均可导致其肠道菌群失调，引起腹泻并导致死亡[15]。随着獭兔生产朝着规模化、集约化发展,腹泻已成为獭兔最主要的疾病之一,给獭兔养殖带来巨大经济损失，在一定时期内，抗生素作为治疗獭兔细菌性腹泻的首选药物，取得了良好的疗效[16]，但是随着“无抗”养殖时代的到来，在不使用抗生素的条件下防治獭兔腹泻病，为养殖户带来了新的挑战，益生菌作为抗生素的重要替代品，在獭兔生产中地位至关重要。时云朵的报道提示，在许多对益生菌治疗獭兔疾病的研究中，所使用的并非獭兔源益生菌，故獭兔源益生菌的筛选应用研究有待进一步加强[6]，本试验分离得到的菌株，可应用于后续研究獭兔源益生菌制剂，增加了可应用于獭兔源微生态制剂的后备菌株，以期开发适用于獭兔生产的优质微生态制剂。