雏鸡性别与蛋壳钙含量和显微结构的相关性研究

刘韬虞，边胤豪，王宇，吴红翔，黄靖，王甜，徐静若，黄宗玲

(江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

我国家禽养殖已有5 000多年历史。自20世纪80年代以来,取得快速发展，正在向标准化现代化生产迈进[1～2]。在种蛋的孵化过程中人们不仅关心雏鸡的数量和质量，而且更多希望孵出母鸡，少出公鸡，从而提高生产效益。雏公鸡由于没有蛋用价值、生长速度慢，刚出壳就被淘汰，从而引起了一些社会人士对动物福利的担忧。如果能通过某些手段鉴定性别，使雏鸡性别在发育不久的某个特定阶段就被鉴定出来，被提前筛选，终止孵化。这样既能避免上述问题，又能定向获取所需性别的雏鸡，从而降低成本，获得更大的经济效益。因此鸡性别的控制在现代养鸡生产中有重要意义，然而目前仍没有较好的方法实现这一目标[3]。本试验主要研究海兰灰蛋鸡公母胚蛋蛋壳在显微结构和钙成分含量的差别，旨在为家禽胚蛋蛋壳检测鉴定性别的研究提供更多参考。

1 试验方法

试验采集在江西农业大学动物房饲养了360d的海兰灰蛋鸡孵出雏鸡后的蛋壳，通过骨骼切片制作方法，固定、脱钙软化后制成石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察，比较孵出公鸡和孵出母鸡的胚蛋蛋壳显微组织结构间的差别；同时将蛋壳高温灼烧成灰分后，采用高锰酸钾滴定法，测定灰分中钙的含量，比较孵出公鸡和孵出母鸡的胚蛋蛋壳钙含量的差异，统计分析海兰灰蛋鸡出壳后公母胚蛋蛋壳间的差别。统计数据用SPSS 25软件进行分析。

2 试验步骤

2.1 蛋壳切片制作

挑选公母雏的胚蛋蛋壳各8个。将所有蛋壳放入75%的酒精中消毒杀菌，每个蛋壳分别取钝、中、锐端3部分，并去除内壳膜。按Bouin氏液配方配置溶液[4]，装入包埋盒，固定24h。按脱钙液配方配置脱钙液[5]，将固定完后的蛋壳组织脱钙软化24h，洗涤后进行脱水和透蜡，完成包埋后进行染色，切片。封片后将切片放在显微镜下观察蛋壳的显微结构并使用电脑拍照软件拍照。

2.2 蛋壳中钙含量的测定

挑选公母雏的胚蛋蛋壳各6个，将带壳膜的蛋壳放进粉碎机中粉碎。干燥后取出，在电炉上碳化，再放入马福炉中灼烧。用高锰酸钾滴定法测出蛋壳中的钙含量。

3 结果

3.1 蛋壳组织切片脱钙后HE染色结果

由图1可见，公雏的胚蛋变化明显：钝端的壳形在脱钙、包埋、染色等处理之后，圆弧度形态变为直线形，深色的晶体层多为卟啉物质，分离或断裂或不见，致密的栅状层也散在断开，与厚厚的乳头层端间隙大，棕红色乳头层的结构也松弛。相对于公雏胚蛋，母雏胚蛋壳保持着一定的完整性和弹性，组织结构依然可见，晶体层、栅状层、乳头层之间层次有序，没有分离与分枝，结构细致结实。

图1 公母雏胚蛋蛋壳钝端结构差异比较（40×10倍）

由图2可见，公雏胚蛋中端的壳形在脱钙、包埋、染色等处理之后，大多圆弧度形态依然变为直线形或浅弧度形态，深色的晶体层公雏蛋壳第1张可见，其它已经散开或点状存在或断裂或不见，致密的栅状层也散在断开，分布在厚厚的乳头层边上，内壳膜网状层仅见点状残迹，棕红色乳头层的结构与母雏胚蛋壳没有太多差异。相对于公雏胚蛋，母雏胚蛋壳大数依然保持着一定的完整性、层次性和弹性，组织结构依然可见，晶体层、栅状层、乳头层之间层次有序，少数也有分离分枝。

图2 公母雏胚蛋蛋中端蛋壳结构差异比较（40×10倍）

由图3可见，公雏胚蛋锐端的壳形在脱钙、包埋、染色等处理之后，大多圆弧度形态依然保持弧度形态，一部份厚厚的乳头层不见了，可能是其中的大量碳酸钙、碳酸镁、多种微量元素在处理中因松弛脱落，其它部分保持了完整性。母雏胚蛋壳大数依然保持着一定的完整性、层次性和弹性，组织结构依然可见，晶体层栅状层乳头层之间层次有序，少数也有分离与分枝。公胚蛋壳的乳头层厚于母胚蛋。

图3 公母雏胚蛋锐端蛋壳结构差异比较（40×10倍）

通过将公母雏胚蛋蛋壳钝端、中端、锐端的HE染色结果进行对比观察，发现公母雏胚蛋蛋壳显微结构的存在差别。母雏胚蛋蛋壳组织表面晶体层紧致且较清晰，公雏胚蛋不明显且有间断；母雏胚蛋壳清晰，乳突颗粒连接更紧密。说明蛋壳基质部母雏胚蛋结实。公雏胚蛋壳的乳头层厚于母雏胚蛋，说明公雏胚蛋的厚度大。

3.2 公母雏胚蛋蛋壳钙含量

从表1可知孵出公雏的胚蛋蛋壳和孵出母雏的胚蛋蛋壳钙含量差异显著。

表1 公母雏胚蛋蛋壳钙含量 %

碳酸钙是蛋壳的和重要组成部分，蛋壳中还含有多种微量元素，如锌、铜、锰、铁等。蛋壳的有机基质由蛋壳膜、乳头状核心、蛋壳基质和油质层组成。公胚蛋壳钙含量极显著高于母胚蛋（P＜0.01）。

4 分析讨论

蛋壳是一种结合非常完全的生物钙，由无机物和有机蛋白质联结而成，有机物一般占整个蛋壳的4%，无机物占蛋壳的96%左右。无机物中主要包含碳酸钙、碳酸镁、碳酸钙和碳酸镁混合物等[6]。

通过实验对比观察，发现公母雏胚蛋蛋壳显微结构的存在差别。母雏胚蛋蛋壳组织表面晶体层紧致且较清晰，公雏胚蛋不明显且有间断；公雏胚蛋蛋壳组织乳头层较母雏胚蛋壳清晰，乳突颗粒连接更紧密，母雏胚蛋组织纹理清晰不厚实。蛋壳分为三层，厚度一般在300um左右，从内至外依次包括乳头层、栅状层和晶体层。最里层的乳头层，大概占蛋壳厚度的1/3，即100um左右。中间层为栅状层，由钙质纤维交错构成，其厚度约占蛋壳厚度的2/3，即200um左右。表皮层是蛋壳最外面的包被部位，厚度一般为10um,主要由含钙盐较多的物质构成，其结构一般来说不间断；里层蛋壳为乳头层，影响着蛋壳的晶体发育，大多为乳头状，具有许多乳状锥形体，锥体层厚约50um[7～9]。公母雏胚蛋结构差异揭示母禽体内相关激素水平及受精后胚蛋激素水平是影响公母结构差异的主要因素，蛋壳受到某种信息传递导致变化，使结构存在差异，同时后期胚蛋生长发育中，获取公母胚吸收蛋壳中养分差异，导致蛋壳中成分的差异。

实验还发现公雏胚蛋蛋壳栅栏层、乳头层厚度高于母雏胚蛋蛋壳。分析其原因是在形成蛋壳的过程中，蛋在子宫液中，而子宫液中有丰富钙和碳酸根离子，蛋壳钙化需要它们的不断供应。蛋壳的有机基质（蛋白质、多糖和蛋白聚糖）分泌入子宫液中。因为在每个阶段具有特定作用的特异蛋白质存在于子宫液中，所以有机基质与蛋壳形成过程中的调控紧密相关。蛋壳的基底层和栅栏层的蛋白质组成差异即这些不同的蛋白质谱影响了晶体的生长机制。在蛋壳发育过程中基质蛋白能够通过调节蛋壳晶体生成来干扰蛋壳钙化进程[10～11]。孵出公鸡的蛋壳和孵出母鸡的蛋壳内的有机基质由于核酸差异（即雄性胚胎DNA比雌性胚胎高约2%[12]），激素成分不同，所以造成蛋壳组织结构和钙成分含量有差异。公雏胚蛋壳钙含量极显著高于母雏胚蛋（P＜0.01），与公雏胚蛋最厚的乳头层厚度有一定的正相关性。

5 结论

不同性别胚蛋蛋壳脱钙后组织显微结构与钙含量存在差异，有关出壳性别与蛋壳的其他差异关系有待进一步研究。