柚皮素对急性肺损伤小鼠保护作用的机制研究

陈倩倩 王荣丽

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种危及生命的临床综合征，其特征是肺泡上皮损伤和肺水肿液大量聚集引起的呼吸衰竭和顽固性低氧血症[1]。有效清除肺水肿液可以改善氧合功能并缩短机械通气时间[2]。血清和糖皮质激素诱导激酶1(SGK1)参与Na+主动转运及肺水肿液的清除[3]。Na+通过钠通道(ENaC)进入肺泡上皮细胞，进而被钠钾泵(Na+-K+-ATPase)泵出，由此产生的渗透压驱动水的重吸收[4]。其中，α-ENaC和Na+-K+-ATPase α1具有重要作用[5-6]。柚皮素广泛存在于柑橘等水果中，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用[7]。研究表明柚皮素能减轻ALI小鼠肺部炎症[8-9]。然而，柚皮素能否通过SGK1通路保护脂多糖诱导的ALI仍有待研究。本研究用脂多糖构建ALI小鼠模型，以柚皮素预处理，探讨对ALI小鼠的治疗作用及可能的作用机制。

资料与方法

一、实验动物、试剂、仪器

4～6周龄雌性BALB/c小鼠15只，体质量约20g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2020-0018，饲养条件：室温20℃，空气湿度50%～55%，昼夜12h，严格按照标准喂养。柚皮素、脂多糖购自上海阿拉丁公司；TNF-α、IL-1β 酶联免疫测定试剂盒购自武汉ELK公司；磷酸化SGK1抗体(p-SGK1 Ser422)购自美国Sigma公司；α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1、GAPDH 抗体购自美国Abcam公司；RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒购自武汉ASPEN公司；全自动酶标仪购自Diatek公司；全自动血液分析仪构自瑞士罗氏公司。

二、动物分组及造模

15只BALB/c小鼠适应性喂养7天后，随机分成Control组、LPS组、LPS+Nar组，n=5。模型制备[7-8]：LPS+Nar组予以柚皮素(100mg/kg)灌胃预处理，连续4天，每天1次，Control组和LPS组予以等量生理盐水灌胃。末次灌胃2h后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，固定于操作台上，LPS+Nar组和LPS组气管内一次性滴入脂多糖(5mg/kg)建立小鼠ALI模型，Control组气管内滴入等量生理盐水，各组小鼠于造模成功后24h取腹主动脉血、双肺组织待检。

三、肺组织病理学观察

收集各组小鼠右肺上叶组织，洗净后放于4%多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋、5μm厚切片，HE 染色观察肺组织病理改变。

四、动脉血氧分压(PaO2)及氧合指数(OI)检测

小鼠处死前，用肝素注射器经腹主动脉抽取动脉血0.5 mL进行血气分析，测定PaO2，并计算氧合指数(Oxygenation index，OI=PaO2/FiO2，FiO2取21%)。

五、肺组织湿/干比值(W/D)测定

取右肺下叶组织精确称重，记为湿重(W)，然后放置于75℃烤箱中烘烤36h至恒定重量后称重，记为干重(D)，计算肺组织W/D值。

六、ELISA 法检测肺组织中TNF-α、IL-1β表达水平

取少许左肺上叶组织用匀浆器充分匀浆，离心后收集上清液，按照试剂盒说明书进行操作，在450 nm波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算肺组织中TNF-α、IL-1β含量。

七、Western blot法检测肺组织中p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达

我国现存最早的私家藏书楼是天一阁。始建于明朝嘉靖四十年（公元1561年），位于位于浙江宁波的天一阁，由范钦主持建造，所藏各类书籍达七万余卷。是中国现存最早的私家藏书楼，也是世界最早的三大私家图书馆之一。

取适量左肺下叶组织，加入RIPA裂解液，收集上清液测定总蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，洗膜后加入α-ENaC 抗体(1∶1000)、p-SGK1抗体(1∶500)、Na+-K+-ATPase α1抗体(1∶500)，4 ℃摇床过夜，TBST 洗膜3次，每次5 min，加入对应的辣根过氧化物标记的二抗37 ℃孵育30min，TBST洗涤4次，每次5 min，ECL 显色，使用图像分析系统对蛋白条带进行扫描，计算各蛋白的相对表达量。

八、统计学处理

结 果

一、造模后各组小鼠一般情况

Control组精神较好、反应灵活、呼吸平稳、活动及进食正常；LPS组精神萎靡、反应迟钝、嘴唇发绀、呼吸急促、尿少、活动及进食明显减少；LPS+Nar组小鼠一般情况介于Control组和LPS组之间，精神尚可，活动及进食有所减少。

二、Nar对ALI小鼠肺组织病理变化的影响

图1 各组小鼠肺组织病理改变(HE×200)

三、Nar对ALI小鼠PaO2、OI、W/D的影响

与Control组相比，LPS组腹主动脉血PaO2、OI降低(均P<0.05)；与LPS组相比，LPS+Nar组PaO2、OI升高(均P<0.05)。与Control组相比，LPS组肺组织W/D值增加(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+Nar组W/D值降低(P<0.05)(见表1)。

表1 各组小鼠动脉血氧分压、氧合指数及湿干重比

四、Nar对ALI小鼠肺组织TNF-α、IL-1β表达水平的影响

与Control组相比，LPS组肺组织TNF-α、IL-1β表达升高(均P<0.05)；与LPS组相比，LPS+Nar组TNF-α、IL-1β表达降低(均P<0.05)(见表2)。

表2 各组小鼠肺组织TNF-α、IL-1β表达水平

五、Nar对ALI小鼠肺组织p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达水平的影响

与Control组相比，LPS组肺组织p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达降低(均P<0.05)；与LPS组相比，LPS+Nar组p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达升高(均P<0.05)(见图2、表3)。

图2 各组小鼠肺组织p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达水平

表3 各组小鼠肺组织p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达水平

讨 论

柚皮苷及其苷元柚皮素作为一种天然的植物化合物，前期的研究表明具有显著的镇咳、祛痰、抗肺部炎症等作用，已被研制成国家一类新药，在临床中的应用逐步增加[10]。Chen等[11]人表明柚皮素通过抑制氧化应激和肺部炎症对百草枯诱导的急性肺损伤和肺纤维化具有治疗作用。Lin等[12]发现柚皮素通过抑制自噬，对肺炎支原体感染后的气道重塑有改善。但柚皮素通过SGK1信号通路改善脂多糖诱导ALI的相关报道较少。本实验采用脂多糖气管滴入构建ALI小鼠模型，并运用此模型探究柚皮素对ALI的保护作用及可能的机制。HE染色结果显示LPS组炎症细胞浸润、肺泡上皮坏死脱落、肺泡壁塌陷、间隔增宽、肺泡腔内可见红细胞，W/D值及TNF-α、IL-1β升高，PaO2降低、OI小于300，说明脂多糖诱导ALI小鼠模型制备成功。

ALI是由于各种因素如细菌感染、败血症、严重创伤导致的肺部过度炎症反应，引起肺泡-毛细血管屏障受损和通透性增加[3]。炎症在ALI期间起着核心作用，促炎因子与抗炎因子的比例失衡是ALI发生的重要一环。TNF-α、IL-1β是由炎症细胞分泌的促炎因子，在启动早期炎症反应和维持炎症方面起关键作用[13]，可调控炎症的严重程度和持续时间，促使中性粒细胞聚集、激活，通过“瀑布式反应”导致严重的肺部损害[14-15]。既往研究表明，柚皮素能改善脂多糖诱导的ALI小鼠肺部炎症[16]。本研究结果显示LPS组肺组织损伤严重，TNF-α、IL-1β表达水平较Control组增加。与LPS组相比，柚皮素预给药能减轻肺组织损伤、下调TNF-α、IL-1β表达，说明柚皮素在一定程度上可减轻ALI小鼠肺部炎症，与之前的研究结果相符合。

目前ALI暂无特异性治疗药物，肺保护性机械通气仍是主流的治疗方法，尽管能改善部分患者的预后，但病死率仍居高不下[17]。有研究报道减轻肺水肿是促进患者预后和降低病死率的重要措施。ENaC被认为是肺水肿液清除的中心环节，和位于基底外侧的Na+-K+-ATPase协同将Na+从肺泡腔转运到间质或毛细血管中，两者共同维持着肺部微环境的稳定[18]。ENaC是一种非电压依赖性的离子通道，是上皮细胞主要的Na+转运通道之一，属于ENaC/退化蛋白家族，主要分布于人体肺部、肾脏、结肠、生殖道及中枢神经系统[19]。肺组织ENaC由位于肺泡上皮细胞顶端的三个亚单位(αβγ)组成，α亚基是ENaC的功能性亚单位[2]。有研究报道缺乏α-ENaC的大鼠在出生后死亡率增加了四倍[20]。由此推测α-ENaC可能是治疗ALI的优选靶点。Na+-K+-ATPase由α和β两个亚单位组成，目前已发现四种Na+-K+-ATPase α单位亚型(α1-α4)[21]。在肺内α1亚单位在肺泡I和Ⅱ型上皮细胞中均有表达[6]。亦有研究发现在急性缺氧条件下，α1亚单位磷酸化会触发Na+-K+-ATPase内吞作用使其活性降低[22]。α1可能是维持Na+-K+-ATPase活性的重要组成部分，本实验选择Na+-K+-ATPase α1为检测指标。

SGK1最初是在乳腺肿瘤细胞系中发现，属于Ser/Thr蛋白激酶，有SGK2和SGK3两种同源体，参与离子转运、自噬和增殖等[23]。SGK1受磷酸化/去磷酸化调节，磷酸化的SGK1(p-SGK1)是其活性形式。研究发现神经前体细胞表达的发育下调基因4(Nedd-4)可使α-ENaC泛素化从而降低α-ENaC活性，SGK1通过阻断Nedd-4对α-ENaC的泛素化作用，保留了α-ENaC的功能和活性，增强对Na+的主动转运能力[24]。SGK1还可直接磷酸化α-ENaC丝氨酸残基从而增强其转运Na+的能力和活性[25]。以上研究表明SGK1可能是促进α-ENaC蛋白表达，减轻肺水肿的重要信号途径之一。为了进一步探究柚皮素是否能通过调控SGK1信号通路起到肺部保护作用，本实验检测了各组小鼠肺组织α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达水平。结果显示LPS组肺组织α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达较Control组降低，经柚皮素干预后，α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达较LPS组增加。同时，本研究还发现LPS组肺组织p-SGK1蛋白表达较Control组降低，柚皮素处理后其表达水平较LPS组增加。以上结果提示柚皮素可能通过激活SGK1，促使α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达增加，进而减轻肺组织水肿。

综上所述，柚皮素通过抑制炎症介质的释放及上调α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表达对脂多糖诱导的ALI小鼠具有保护作用，其机制可能与激活SGK1信号通路有关，但关于柚皮素激活SGK1的确切机制有待更深入的研究。