百里香叶片挥发性物质物候节律

李兆祺，司家屹，杨秀云

（山西农业大学林学院, 山西 太谷 030801）

植物在次生代谢过程中会产生许多分子量低且易挥发的化学物质，这类物质是植物与外界环境进行相互作用的重要媒介[1-3]。植物释放的挥发性物质不仅对自身生长、繁衍、抵抗逆境胁迫具有重要作用[4-6]，而且会在改变大气质量、预防人体疾病和调节情绪等方面产生一些影响[7]。近年来，我国园林绿化工作者在保证城市景观效果的同时兼顾其康养价值[8]，部分植物挥发性次生代谢产物对人体有一定的保健作用，具有挥发性物质的园林植物的开发利用可为建设保健型园林绿地提供物质基础。

百里香(Thymus mongolicus)是唇形科(Labiatae)百里香属一种典型的草本芳香植物，其全株具有诱人的香气，是重要的食用、药用和蜜源植物，同时在保持生态和园林观赏等方面也具有较高价值，是极具开发潜力的芳香植物[9]。目前世界上记载的百里香有350余种，我国百里香种质资源众多，与国外品种相比，我国的百里香适应性较强，病虫害较少，栽培成本低，但是有效成分芳香油的含量以及自然状态下释放的挥发性物质含量低，观赏价值也较国外低[10]。当前国内学者对百里香的研究主要集中在花色、挥发性气味、精油提取等方面[10-12]，对其不同物候期与挥发性物质释放量的关系的研究尚鲜少报道。因此，对百里香的挥发性物质在不同物候条件下的释放节律的研究，有利于我国百里香资源的进一步开发应用以及营造康养型植物景观。

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术，分析不同物候期百里香叶片挥发性物质的种类与含量，旨在探明百里香挥发性物质释放节律，以期为百里香的进一步推广应用及植物叶片挥发性物质的相关研究提供基础的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年4月至9月在山西农业大学林业站百里香种质资源圃进行。该地区位于112°57′23.11″ E，37°85′27.96″ N，属温带大陆性季风气候。试验材料为引种自浑源地区的野生百里香植株。分别在生长旺盛期(4月17日)、开花期(5月14日)、结果期(8月20日)和衰败期(9月27日)4个物候期间，于10:00采用多株混合取样法，选取生长健壮、无病虫害侵染的百里香成熟叶片，用蒸馏水冲洗干净后，每份样品称取0.5 g，3次重复。

1.2 试验方法

1.2.1 顶空固相微萃取

分别精确称取0.5 g百里香叶片，剪碎置于20 mL萃取瓶内并迅速密封。萃取条件：萃取头为DVB/CAR/PDMS，50 ℃震荡15 min，吸附5 min，进样温度为270 ℃，解吸附5 min，进行GC-MS检测。

1.2.2 GC-MS检测

色谱条件：色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱，载气为高纯氦气，流速为1 mL·min-1，采用不分流进样方式，起始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升温至270 ℃，保持6 min。

质谱条件：离子源为EI源，离子传输线温度为250℃，离子源温度为230 ℃，质量扫描范围50～550 amu。

1.2.3 挥发性成分定性定量方法

定性方法：根据GC-MS检测得到的质谱信息，采用计算机数据处理系统与NIST质谱库进行比对，对挥发物成分进行鉴定。

定量方法：以右旋龙脑(纯度 ≥ 99%，湖南晃龙公司生产)为外标，根据右旋龙脑标准品的浓度(y)和峰面积(x)绘制标准曲线(y= 0.000 000 000 13x+0.042 083 942 95，R2= 0.991)，挥发物的含量 = 浓度 ×内标体积/样本质量。

1.3 数据分析

使用Excel 2010和SPSS 19.0软 件对所测数 据整理分析，用平均值 ± 标准误差表示测定结果，采用Duncan法对不同采样时期各类挥发性物质含量多重比较，采用Origin 9.0软件绘图。

2 结果

2.1 不同物候期百里香叶片释放的挥发性物质种类及含量分析

百里香叶片在4个物候期中共检测出69种挥发性物质，但是不同物候期释放的挥发性物质在种类上存在着明显的差异(表1)。百里香叶片的挥发性物质种类随着物候期的变化呈下降趋势。其中，生长旺盛期的种类最多为53种，开花期和结果期分别为50种和43种，而衰败期仅有28种。

表1 不同物候期百里香叶片释放的挥发性物质及含量Table 1 Volatile components and amounts released from Thymus mongolicus leaves at different phenological periods

续表1 (1)Table 1 (Continued)

续表1 (2)Table 1 (Continued)

在各物候期的百里香叶片中释放种类最多的挥发性物质均为烯烃类化合物，表现为生长旺盛期(23种) ＞ 开花期(21种) ＞ 结 果期(20种) ＞ 衰败期(13种)；醇类挥发性物质在生长旺盛期释放种类相对较多(10种)，而在开花期和结果期均释放了7种，衰败期释放了6种；芳香烃类挥发性物质种类在开花期最多(7种)，在衰败期最少(4种)；酯类挥发性物质的种类在生长旺盛期、开花期、结果期和衰败期分别为5种、3种、2种和1种。此外，酮类挥发性物质在各个物候期的释放种类均相对较少，衰败期仅释放了1种挥发物，其余物候期释放了4种挥发物。

不同物候期百里香叶片释放的挥发性物质总量不同(图1)，随着物候期推移呈先升后降的变化趋势，表现为开花期和结果期含量相对较高，分别为163.90和157.21 μg·g-1；而生长旺盛期和衰败期相对较低，分别为104.47和75.42 μg·g-1，显著低于开花期和结果期的含量(P＜ 0.05)。

百里香叶片各类挥发性物质含量在不同物候期间存在差异(图1)。其中，烯烃类挥发性物质在生长旺盛期、开花期、结果期和衰败期含量分别为43.12、85.82、83.52和11.69 μg·g-1，开花期和结果期的含量显著高于其他时期(P＜ 0.05)。醇类挥发性物质在结果期含量最高，为27.30 μg·g-1，衰败期含量最低，仅为8.96 μg·g-1。芳香烃类挥发性物质含量在开 花 期(54.84 μg·g-1)、衰 败 期(53.40 μg·g-1)和 结 果期(43.32 μg·g-1)差异不显著(P＞ 0.05)，但3个时期均显著高于生长旺盛期含量(29.14 μg·g-1)。酮类挥发性物质在结果期(3.01 μg·g-1)释放量最大，显著高于其他物候期。酯类挥发性物质在生长旺盛期(2.32 μg·g-1)的释放量高于开花期(0.80 μg·g-1)、结果期(0.51 μg·g-1)与衰败期(0.13 μg·g-1)。其他类挥发性物质在生长旺盛期释放量(12.27 μg·g-1)均高于其他时期。

图1 4个物候期百里香叶释放的挥发性物质含量Figure 1 Volatile components released from Thymus mongolicus leaves in the four phenological periods

2.2 百里香叶片4个物候期主要挥发性物质的物候节律性变化

4个物候期的百里香叶片共有挥发性物质有23种，其中含量高于3.00 μg·g-1的挥发性物质有11种，主要是烯烃类、醇类及芳香烃类物质。

百里香叶片中烯烃类挥发性物质在不同物候期的变化情况如图2所示。γ-松油烯在开花期的释放量相对较高，为44.96 μg·g-1，明显高于其他各个时期；莰烯、双环[3.1.0]六角-2-烯、月桂烯和桧烯均在结果期释放量相对较高，分别为14.94、13.13、9.09和3.31 μg·g-1，其次为开花期，含量分别为7.35、7.50、7.84和1.83 μg·g-1。反式石竹烯的含量表现为开花期(9.50 μg·g-1) ＞ 生长旺盛期(7.68 μg·g-1) ＞ 结果期(2.81 μg·g-1) ＞ 衰败期(0.97 μg·g-1)；而β-蒎烯含量最大值则出现在结果期，为4.09 μg·g-1。

图2 共有主要挥发物中烯烃类挥发性物质含量Figure 2 Analysis of volatile alkenes among the common major volatiles

百里香叶片中主要的醇类和芳香烃类挥发性物质在不同物候期的变化情况如图3所示。桉叶油 醇 的 含 量 表 现 为 结 果 期(18.90 μg·g-1) ＞ 开 花 期(13.92 μg·g-1) ＞ 衰 败 期(7.06 μg·g-1) ＞ 生 长 旺 盛 期(4.89 μg·g-1)；右旋龙脑在生长旺盛期含量最大(6.41 μg·g-1)，衰败期最小(0.90 μg·g-1)，开花期和结果期分别释放了3.99和4.81 μg·g-1；邻-异丙基甲苯的含量表现为衰败期(52.93 μg·g-1) ＞ 开花期(46.84 μg·g-1) ＞结果期(36.94 μg·g-1) ＞ 生长旺盛期(25.71 μg·g-1)；2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯在衰败期含量最低(0.25 μg·g-1)，与开花期(7.02 μg·g-1)、结果期(5.02 μg·g-1)和生长旺盛期(2.92 μg·g-1)含量差异较大。

图3 共有主要挥发物中醇类和芳香烃类挥发性物质含量Figure 3 Analysis of volatile alcohols and aromatic hydrocarbons among the common major volatiles

3 讨论与结论

植物挥发性物质的合成与释放是植物自身代谢调控和各类环境因子综合作用的结果[13]。随着物候的变化，外界环境因子发生改变，植物也相应进入不同的生长发育时期，其挥发性物质作为生长发育过程中的一种细胞调控信号，伴随自身代谢调控和物候期的变化呈现出相应的动态特征，形成了节律性的差异[14]。蒋冬月等[15]对比了黄金香柳(Melaleuca bracteata)季节动态变化和日变化规律发现，6月检测到的挥发性物质种类相对较多，认为这主要是由于夏季温度升高，光照时间变长，植物代谢途径发生了活跃的变化，从而释放相对较多的挥发性物质。杨素华等[16]研究了樟树(Cinnamomum camphora)叶片挥发性物质的年季变化规律发现，植株5月份释放的挥发性物质种类最多。李娟等[17]研究侧柏(Platycladus orientalis)挥发性物质季节变化规律发现，侧柏挥发物含量随季节变化表现为夏季 ＞ 春季 ＞秋季 ＞ 冬季。郭阿君等[18]对火炬树(Rhus tyhpina)叶片挥发性物质季节动态变化规律进行研究发现，不同季节火炬树挥发性物质种类及相对含量存在差异。春、秋两季以萜烯类化合物为主，夏季烃类化合物比例稍高于萜烯类，同时包含少量的酮类和醇类化合物。本研究表明，百里香春季生长旺盛期种类最多，与其代谢速率相对较强，且叶片需要进行多种途径的代谢活动以满足生长发育的需求有关；在植株进入生殖生长期后，叶片功能发生了变化，需要通过降低代谢速率以满足生殖生长的养分需求，从而导致次生代谢产物种类的减少[19]。不同时期的叶片积累物质由于植物生理需求的不同而产生变化，因此进入衰败期后，生殖生长期间大量的养分消耗和外界气候因子变化的双重影响使植物次生代谢活动进一步减缓，造成这一时期百里香叶片中挥发性物质种类显著降低[20]。

有关研究表明，次生代谢产物在植物的生理调节、生存竞争、自身保护以及协调与环境之间的关系等方面起着重要作用[21]。随季节的变化，外界的光、空气、土壤、温度和湿度等各种生态环境因素以及生物自身的调控均会发生改变，从而影响到植物的次生代谢过程。已有研究证实植物中挥发性物质的释放量与光照、空气、土壤、温度、湿度以及蒸腾速率等环境因子密切相关[22-27]。在本研究中，百里香叶片挥发性物质总释放量在开花期和结果期显著高于其他各生长时期，而生长旺盛期、衰败期挥发性物质含量较低，这是多重因素协同作用产生的结果，是植物通过自身代谢调控以适应外界环境变化的表现。百里香开花期与结果期处于5月下旬到10月之间，此阶段光照时间长，植物叶片可以充分进行光合作用，为植物次生代谢提供了充足的反应前体物质与能量，并且在一定范围内，温度升高会使参与次生代谢有关的酶活性增强，促进挥发性物质释放量的提高[28]。此外，一些学者证实，强烈的蒸腾作用使植物叶片气孔张大，气孔的开合度对植物体挥发性物质的释放具有调控作用[29-30]。本研究在不同物候期选取百里香的叶片部位进行测定，测得挥发性物质含量存在差异的结果，与叶片气孔开度的大小也具有一定的关联。

烯烃类、醇类、酮类挥发物是一类富含碳原子的次生代谢产物，其在衰败期释放量最低，主要是由于植株在进入衰败期前经历了生殖生长期，大量的碳水化合物、激素等养分被消耗，且由于进入衰败期时，外界日照时长、温度等生态环境因子也发生了显著的降低[31]。在本研究中也发现相似结果，在百里香叶片中测得的烯烃类物质在开花期释放量最高，醇类和酮类物质在结果期释放量最高，百里香进入衰败期后，叶片中测得的烯烃类、酮类和醇类挥发性物质的含量均降到最低。百里香叶片中芳香烃类挥发物在衰败期的释放量相对较高。芳香烃类的挥发物质是由苯丙烷代谢途径产生的，与植物抗性联系密切，已有研究证实，光照、温度、病虫害、机械损伤、外源激素等都能够诱导苯丙烷代谢途径相关酶系的活性增加[32-35]，酶活性的增加在一定程度上促进了其调控产物的积累量。由于衰败期受到外界的光照、温度、土壤水分含量等环境因子的刺激，植物会通过生理代谢上的策略，即加速次生代谢来应对和克服胁迫条件[30]。因此，挥发性物质的释放与有关酶活性的研究对揭示百里香挥发性物质释放的物候节律也尤为必要。

本研究表明，在4个物候期从百里香叶片中共检测出69种挥发性物质，其中生长旺盛期释放种类最多为53种，其次为开花期50种，结果期和衰败期分别有43种和28种。百里香叶片挥发性物质总释放量在开花期和结果期显著高于生长旺期和衰败期。其中含量高于3.00 μg·g-1的挥发性物质有11种，主要是烯烃类、醇类及芳香烃类物质随物候期变化表现出差异性特征。