PD-1抑制剂对小鼠肺组织炎症微环境及损伤的影响*

曹丽，吴碧波，周开艳，耿一超，刘凌枫，王刚，旷华香，卢冰，苏胜发

550004 贵阳，贵州医科大学附属医院 肿瘤科;550004 贵阳，贵州医科大学附属肿瘤医院 肿瘤科

药物治疗在恶性肿瘤的治疗中占有重要地位，化疗、靶向治疗和内分泌治疗已在恶性肿瘤的治疗中应用多年。近年来，以程序性死亡受体1(programmed death 1, PD-1)抑制剂为代表的免疫检测点抑制剂，也已成为恶性肿瘤的主要治疗方法之一，提高了肿瘤治疗疗效。

PD-1抑制剂通过阻断T细胞上PD-1受体与其配体PD-L1的结合，活化T细胞，增强T细胞对肿瘤的免疫应答，而发挥抗肿瘤作用。同时，PD-1 抑制剂也会导致免疫系统过度激活，引起机体各系统组织产生免疫相关不良反应(immune-related adverse event,irAE)，包括皮肤反应、免疫性肺炎、免疫性心肌炎、免疫性肝炎、免疫性肠炎、甚至神经系统炎症等[1]。随着PD-1抑制剂临床应用的推广，irAE日益受到重视。

Nishino等[2]对20项PD-1抑制剂临床试验，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、肾癌等4 496例病例进行Meta分析发现，免疫性肺炎的发生率约2.7%，3级及以上肺炎发生率为0.8%。免疫性肺炎的发生率虽然较低，但严重的irAE以免疫性肺炎更为常见，导致治疗中断甚至危及生命[3]。有文献报道，在真实世界中免疫性肺炎的发生率可高达20%，3级及以上肺炎发生率为3.4%[4-5]。探索免疫性肺炎的发病机制，对免疫性肺炎的防治具有重要的临床意义。鉴于临床上获取组织标本研究免疫性肺炎困难，本研究拟采用小鼠模型观察PD-1抑制剂对肺组织炎症微环境及损伤的影响，初步探索其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备及试剂

Navios流式细胞仪(中国广州流式生物科技有限公司)、多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，PD-1抑制剂(InVivoMAb anti-mouse PD-1，Bio X cell Co. Ltd. USA BE0146)、同种型对照IgG抗体(InVivoMAb anti-mouse IgG2a isotype control，Bio X cell Co.Ltd.USA BE0085)、兔抗鼠CD3、CD4、CD8抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(武汉赛维尔生物科技有限公司)，多因子(包含 IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ因子)检测试剂盒(美国BioLegend公司)、羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，HE染色及Masson染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 动物分组及处理

15只健康状况良好的C57BL/6小鼠，月龄6～8周，体重20～25 g，各种反射正常，养殖于贵州医科大学SPF级动物基地[合格证号:SCXK(黔)2018-0001]，颗粒饲料喂养，自由进食及饮水，清洁舒适环境(温度：23～25℃，湿度：45%～55%)。随机分为3组，每组5只；A 组为正常对照组，B 组为IgG组，C 组为PD-1抑制剂组。用药剂量参考文献给予[6-7]，PD-1抑制剂给药方法：第1、2、3周每周给予PD-1抑制剂200 μg+1 mL生理盐水腹腔注射，随后每周给予PD-1抑制剂100 μg+1 mL生理盐水腹腔注射，连续3周；IgG给药方法：给药时间点、剂量与给药途径同PD-1抑制剂；A组在相同的时间点，通过相同途径给予等量的生理盐水。

1.3 标本采集及处理

给药后第7周用6%水合氯醛麻醉处死各组小鼠，取出肺组织，将左肺组织分为两部分。一部分用10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，按3 μm厚度切片，用于HE、Masson及免疫组化染色；另一部分用于羟脯氨酸含量测定和流式细胞术检测，剩下的肺组织保存至-80°超低温冰箱保存。

1.4 HE染色

常规石蜡切片脱蜡至水，苏木素染液染3～5 min，水洗、分化液分化、水洗、返蓝液返蓝、冲洗后85%、95%的梯度酒精脱水各5 min，伊红染液染色5 min，无水乙醇脱水透明后中性树胶封片。光学显微镜下观察肺组织形态及病理变化，每张标本随机选取5个不重复视野。

1.5 Masson染色

按照产品说明书进行染色。光学显微镜下观察，经Masson染色后小鼠肺泡上皮细胞被染为红色，胶原纤维被染为蓝色。采用ImageJ图像分析软件进行胶原半定量分析，计算肺组织胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)，CVF=视野中胶原面积/视野总面积，每张标本随机选取5个不重复视野。

1.6 免疫组化染色

石蜡切片脱蜡至水，置于微波炉内进行抗原修复，用3%过氧化氢室温孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗后滴加3%牛血清白蛋白室温封闭30 min。然后滴加对应的一抗，4℃孵育过夜。过夜后PBS洗净，滴加对应的二抗，室温孵育50 min。PBS洗净后滴加DAB显色液染色3 min，染色结束后进行苏木素复染3 min左右，最后将切片脱水透明、中性树胶封片。经染色后细胞核为蓝色，阴性对照以PBS代替一抗，DAB显出的阳性表达为棕黄色。镜下采图，每张切片随机选取5个视野,采用ImageJ图像分析软件对肺组织切片进行分析,求得每个视野下CD3、CD4、CD8着色的平均光密度值(average optical density，AOD),AOD=累积光密度值/组织面积。

1.7 羟脯氨酸含量测定

称取小鼠肺组织湿重30 mg放入试管中，剪碎加入水解液1 mL、95℃加盖水浴水解20 min，按照试剂盒步骤依次进行操作。羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)=(测定管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度(5 μg/mL)×水解液总体积(mL)/组织湿重(mg)。

1.8 流式细胞术检测肺组织细胞因子水平

称取小鼠肺组织湿重20 mg，加入PBS 200 μL、苯甲基磺酰氟100 μL，冰上剪碎裂解，匀浆后离心取上清。按照LEGENDplexTMMouse B cell Panel Standard Cocktail，Lyophilized细胞因子检测试剂盒说明书进行操作。取肺组织上清25 μL放入EP管，加入预混Beads及Assay Buffer各25 μL，常温避光孵育2 h，离心弃上清，加入200 μL Wash buffer，离心弃上清，加入检测抗体25 μL，常温避光孵育1 h，加入SA-PE 25 μL，避光孵育30 min，离心弃上清，加入200 μL Wash buffer，离心弃上清，最后每管加入300 μL 1×Wash buffer，上机检测TGF-β1、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-17A等细胞因子。数据用LEGEND plex v8.0软件进行分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，数据符合正态分布的结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著差法，方差不齐时采用Dunnett’s T3方法。P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织的病理学观察

2.1.1 HE染色 A组和B组小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁纤细，肺泡间隔纤细，肺间质无水肿，C组肺泡间隔增厚，肺间质水肿，可见较多的炎症细胞浸润(图1)。

图1 各组肺组织损伤情况(HE染色,×400)

2.1.2 Masson染色评估肺组织纤维化情况及胶原半定量分析 Masson染色胶原纤维被染为蓝色。A组和B组肺组织结构完整，肺间质未见明显的胶原纤维沉积；C组肺组织正常结构紊乱，肺泡间隔增厚，可见蓝染的胶原纤维沉积(图2)。肺组织胶原半定量分析结果显示： A、B、C各组的CVF分别为4.30%±1.06%、5.10%±1.37%、10.70%±2.83%，组间比较发现A、B两组CVF无明显差异，而C组CVF较A组和B组明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01,图3A)。

图2 各组肺组织纤维化情况(Masson染色,×200)

2.2 肺组织羟脯氨酸含量测定

A、B、C各组羟脯氨酸含量分别为(0.116±0.090) μg/mg、(0.120±0.013) μg/mg、(0.160±0.013) μg/mg，A组和B组的羟脯氨酸含量相似，C组羟脯氨酸含量较A、B两组增加，差异有统计学意义(P<0.01,图3B)。

图3 胶原半定量分析和羟脯氨酸含量测定

2.3 CD3、CD4及CD8免疫组化染色结果

免疫组织化学染色结果显示，CD3+、CD4+、CD8+细胞染成棕黄色或棕褐色，C组的CD3+细胞浸润增加，且以CD8+细胞为主，而A、B组中浸润的CD3+细胞无明显差别，CD4+细胞浸润在A、B、C三组中相似(图4)。 与A组相比，B组CD3标记AOD值的差异无统计学意义(t=0.194，P=0.848)，而C组CD3标记的AOD值较A组(t=5.267，P<0.01)和B组增加(t=5.066，P<0.01)，差异有统计学意义。A组与B组CD8标记的AOD值相似(t=0.182，P=0.856)，差异无统计学意义，而C组CD8标记的AOD值较A组(t=7.818，P<0.01)和B组(t=7.636，P<0.01)增加，差异有统计学意义。 A组、B组和C组CD4标记的AOD值相似(t=0.245，P=0.784)，差异无统计学意义(表1)。

图4 免疫组化显示肺组织淋巴细胞浸润情况

表1 各组肺组织中CD3、CD4及CD8标记的AOD计数结果

2.4 肺组织中细胞因子表达情况

2.4.1 IL-6表达情况 A、B、C组IL-6浓度分别为(13.55±3.45) pg/mL、(12.25±3.25) pg/mL、(35.65±6.13) pg/mL。A组与B组的浓度相似(t=0.460，P=0.654)，C组高于A组(t=7.809，P<0.01)和B组(t=8.269，P<0.01)，差异有统计学意义(图5A)。

2.4.2 TGF-β1表达情况 A、B、C组TGF-β1浓度分别为(322.50±23.44) pg/mL、(419.33±66.91) pg/mL、(1 019.77±104.17) pg/mL，各组TGF-β1变化趋势与IL-6相似。A组与B组TGF-β1表达的差异无统计学意义(t=2.017，P=0.067)，C组TGF-β1仍明显高于A组(t=15.068，P<0.01)和B组(t=13.050，P<0.01)，差异有统计学意义(图5B)。

2.4.3 IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ表达情况 各组IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ表达水平均较低，低于设定的检测范围(IL-4<4.05 pg/mL，TNF-α<4.35 pg/mL，IL-17A<6.21 pg/mL，IFN-γ<5.74 pg/mL)。

图5 肺组织中IL-6和TGF-β1的表达情况

2.5 小鼠一般状况及体重变化

各组小鼠精神状态、食欲良好，活动正常，至观察时间点各组小鼠均存活。至观察终点A、B、C各组小鼠体重分别为(26.39±3.84)g、(25.47±4.60)g、(27.80±2.64)g，体重变化的差异无统计学意义(t=1.732，P=0.187；图6)。

图6 各组小鼠体重变化

3 讨 论

药物治疗在恶性肿瘤的治疗中起着举足轻重的作用，部分抗肿瘤药物可以导致肺损伤。化疗药物中，博来霉素的肺毒性较为常见，可导致患者出现非特异性肺炎和肺纤维化，甚至迅速死于肺纤维化，而其机制尚不完全清楚[8]。多西他赛广泛用于治疗多种实体肿瘤，也可导致罕见且严重的间质性肺炎，可能与I型和IV型超敏反应相关[9]。分子靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)间质性肺炎的发生率约5%[10]。PD-1抑制剂可活化T淋巴细胞，导致免疫性肺损伤，有文献报道其发生率约3%～4%[2,11]。

本研究观察了PD-1抑制剂对小鼠肺损伤的影响，并从免疫微环境的角度初探其潜在机制。组织病理观察发现PD-1抑制剂导致小鼠肺泡间隔水肿、增厚，炎症细胞浸润，肺间质胶原纤维沉积增多，羟脯氨酸含量增高，表明PD-1抑制剂可导致的小鼠肺损伤和纤维化。大多数临床研究数据也显示，PD-1抑制剂所致免疫性肺炎的发生率较低(3%～5%)，3级及以上肺炎仅约1%[2,11-12]。在临床上PD-1抑制剂单药治疗NSCLC的临床疗效并不理想，整体有效率仅约20%～30%，联合靶向、化疗或放疗的综合模式能够进一步提高疗效[13-14]。PD-1抑制剂单独使用时肺炎发生率虽然较低，需要注意的是PD-1抑制剂联合其它治疗方式可能增加肺损伤的风险，应当引起重视。Oshima等[10]报道，EGFR-TKI联合PD-1抑制剂(nivolumab)时间质性肺炎的发生率高达25.7%，EGFR-TKI联合nivolumab时发生间质性肺炎的风险比单独使用nivolumab增加5.32倍。放射性肺损伤的本质是淋巴细胞性肺泡炎，PD-1抑制剂可活化T淋巴细胞，故PD-1抑制剂与放疗联合应用时也有加重放射性肺损伤的风险[15-16]。

PD-1抑制剂主要通过活化T淋巴细胞介导免疫性损伤，免疫炎症微环境在PD-1抑制剂所致肺损伤中起着重要作用。本研究发现，PD-1抑制剂组的肺组织中CD3+T淋巴细胞浸润显著增多。进一步分析发现，主要是肺组织中浸润的CD8+T淋巴细胞增加，CD4+T淋巴细胞浸润不明显。本研究结果提示，CD8+T淋巴细胞浸润，而不是CD4+T淋巴细胞在PD-1抑制剂所致肺损伤中起着重要作用。Laubli等[17]报道黑色素瘤患者使用PD-1抑制剂后诱发免疫性心肌炎，患者出现严重急性左心衰，进行心肌活检，也发现心肌组织中大量CD8+细胞浸润，经皮质类固醇激素治疗后迅速好转。这些研究结果表明，CD8+T淋巴细胞在PD-1抑制剂所致正常组织的免疫损伤中起着关键作用。同时，CD8+T淋巴细胞在抗肿瘤作用中也起着重要的作用，封闭CD8+T细胞虽可减轻PD-1抑制剂的免疫损伤，但势必对其抗肿瘤作用带来负面影响[18-19]。不同的T淋巴亚群，包括Th1、Th2、Th17、Treg细胞等，在不同原因导致的肺损伤中起着相应作用[20-24]。本研究仅初步探索了CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润的情况，进一步深入研究起关键作用的T淋巴细胞亚群或更有助于精准防控PD-1抑制剂所致肺损伤。

细胞因子是免疫炎症微环境的重要构成部分，在肺损伤中起重要作用。本研究检测了IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ因子表达水平，发现PD-1抑制剂使肺组织中IL-6和TGF-β1表达水平显著升高，表明IL-6和TGF-β1在PD-1抑制剂所致肺损伤及纤维化中扮演着重要角色。IL-6和TGF-β1都是重要的促炎和促纤维化因子，在感染和组织损伤的早期有利于组织修复，但过度或持续的产生会使生理性修复转向过度的病理修复，其特征是纤维化形成[25-26]。研究表明，IL-6与TGF-β1对调控CD4+T细胞分化向Th17细胞分化是必不可少的，同时IL-6也抑制TGF-β1诱导的Treg细胞分化[27-28]。Th17/Treg平衡的上调被认为是免疫耐受破坏的原因，与自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病的发生有关[29]。Tabata等[30]发现阻断IL-6信号通路，可抑制肺成纤维细胞活化，改善小鼠放射性肺纤维化程度。IL-6受体阻断剂可用于缓解肿瘤患者免疫治疗导致的炎症综合征，并能缓解类固醇激素难治的PD-1抑制剂相关irAEs[31-32]。目前，阻断TGF-β1介导的信号通路来减轻肺纤维化是研究的热点。临床上使用吡非尼酮延缓特发性肺纤维化的进展，吡非尼酮可通过抑制TGF-β1的关键信号通路，调控人成纤维细胞的增殖和向肌成纤维细胞的分化，减轻肺纤维化[33-34]。Macitentan能减轻TGF-β1诱导的肺纤维化和肺动脉高压的发展过程[35]。现实条件下，阻断IL-6和TGF-β1的相关通路可能是减轻PD-1抑制剂所致肺损伤的简便、快捷的有效方法，值得进一步探索。Kowalski等[36]发现，与健康人群比较，免疫检测点抑制剂相关肺炎患者肺泡灌洗液中的IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ表达水平无明显变化。本研究发现，小鼠给予PD-1抑制剂处理后，肺组织中IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ表达无明显变化。结合临床与动物实验的结果，表明IL-4、IL-17α、TNF-α及IFN-γ在免疫检测点抑制剂所致肺损伤中的作用轻微。

综上所述，PD-1抑制剂可导致肺损伤，尤其是与其它抗肿瘤方式联用时，应当重视肺损伤的风险增加。CD8+而不是CD4+T淋巴细胞在PD-1抑制剂所致的肺损伤中起着重要作用，关键的T细胞亚群值得进一步探索。IL-6和TGF-β1扮演着重要角色，阻断IL-6和TGF-β1的相关通路可能有助于减轻PD-1抑制剂所致肺损伤。更为深入地研究PD-1抑制剂导致肺损伤的免疫微环境调控机制，对精准防治PD-1抑制剂所致肺损伤具有重要意义。

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