复合酶法制备杨梅汁工艺优化及品质分析

马剑，路高勇，陈智玲，高志红，李志强，王愈，马艳弘*

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.丰县市场监督管理局综合检验检测中心，江苏 徐州 221700；4.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）

杨梅[Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.]是一种具有高经济价值和营养价值的杨梅科杨梅属亚热带常绿植物，在国内外均有种植[1]。杨梅富含酚酸和黄酮等物质，是一种对人体健康有益的水果[2]。杨梅汁液丰富、采收期短，不耐储存，每年至少30%以上的杨梅鲜果会腐烂变质，给果农造成了很大的经济损失。因此开展杨梅的深加工技术研究，降低资源浪费率并提高杨梅附加价值，具有深远的意义[3]。目前市场上常见的杨梅加工产品包括糖水杨梅罐头、果酱、果汁、果酒等[4]，其中杨梅汁因具有较高的营养价值和较好的口感、风味，在市场上备受青睐。

生物酶解法是果蔬汁制备过程中较常应用的技术手段，酶解不仅可以有效破坏植物细胞壁、更好地释放细胞内容物，提高果蔬出汁率，还有利于果蔬汁的澄清稳定和色泽改善。杨电增等[5]、刘义庆等[6]、BIAN等[7]研究发现，在多糖、番茄红素等生物活性物质的提取以及果蔬汁的制备方面，纤维素酶和果胶酶具有协同增效的作用。杨梅汁独特的香气和酸甜味，是其成为消费者优选的重要因素[8-9]。气相色谱质谱仪用于分析挥发性化合物的分子式和分子结构[10-11]，FANG等[12]研究发现，薄荷醇、石竹烯、4-松油醇、芳樟醇氧化物、芳樟醇和乙酸等化合物，构成杨梅果实独特的香气，但酶解后杨梅汁营养物质是否会发生变化，此类研究相对较少。

本研究采用纤维素酶和果胶酶酶解法制备杨梅汁，考察果胶酶与纤维素酶质量比、复合酶添加量、酶解温度和酶解时间对杨梅出汁率的影响，优化其制备工艺[13]，并研究复合酶酶解法对杨梅汁营养成分、色泽、功能成分、抗氧化活性以及挥发性成分的影响，为高品质杨梅汁的制备提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟期荸荠杨梅：南京福晶农业科技有限公司；果胶酶（≥40 U/mg）、纤维素酶（≥50 U/mg）：上海蓝季生物公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三吡啶基三嗪（tripyridine triazine，TPTZ）、苯酚、浓硫酸、福林酚、硝酸铝：南京化学股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MJ-PB40E253C多功能榨汁机：美的集团股份有限公司；D-8紫外可见光分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；WSC-S色差仪：上海仪电物理光学仪器公司；WGZ-800浊度计；上海昕瑞仪器仪表有限公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；WZS手持折光仪：邢台钜都科技有限公司；PHS-25型pH计：上海科晓科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杨梅汁的制备

将新鲜杨梅清洗、去核、打浆、称重，再加入一定量的果胶酶和纤维素酶，不同温度下酶解一定时间，在5000 r/min离心15min后取上清液，计算杨梅出汁率。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 果胶酶与纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响

复合酶添加量0.40%、酶解温度50℃、酶解时间60 min条件下，考察果胶酶与纤维素酶质量比（4∶0、3 ∶1、2∶2、1 ∶3、0 ∶4）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.2 复合酶添加量对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比3∶1、酶解温度50℃、酶解时间60 min条件下，考察复合酶添加量（0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.3 酶解温度对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比3∶1、复合酶添加量0.40%、酶解时间60 min条件下，考察不同酶解温度（25、35、45、55、65、75 ℃）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.4 酶解时间对杨梅出汁率的影响

以果胶酶和纤维素酶质量比为3∶1，复合酶添加量为 0.40%，酶解温度 45℃，考察酶解时间（0、30、60、90、120、150、180 min）对杨梅出汁率的影响。

1.3.3 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，因复合酶质量比对杨梅出汁率影响较小，选取复合酶添加量、酶解温度和酶解时间为因素，通过响应面分析，优化杨梅出汁率最优工艺参数。具体因素及水平如表1所示。

表1 因素及水平编码Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.4 杨梅汁理化指标测定

采用苯酚硫酸法[14]测定总糖含量；采用福林酚法[15]测定总多酚含量；采用分光光度计法[16]测定总黄酮含量；采用pH试差法[17]测定花色苷含量；采用考马斯亮蓝法[17]测定蛋白质含量；采用pH计测定pH值；采用电位滴定法[14]测定总酸含量；采用手持折光仪测定可溶性固形物含量；采用浊度仪法测定浊度；采用色差仪测定L值、a值、b值，以及在420、520、620 nm处测定杨梅汁的吸光度，根据参考文献[18]计算色度（CD=A420+A520+A620）、色调（T=A420/A520）。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 DPPH自由基清除率测定

根据参考文献[13]，取杨梅汁1mL于刻度试管，加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL，摇匀后避光放置30 min，取上清液，测定517 nm波长处的吸光度。DPPH自由基清除率计算公式如下。

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.5.2 羟基自由基清除率测定

根据参考文献[13]，取杨梅汁1 mL于刻度试管，再加入2 mg/mL FeSO4溶液、1.5 mg/mL水杨酸溶液、1% H2O2溶液各1 mL，37℃水浴下避光反应15 min，在526nm波长处测定吸光度，·OH清除率计算公式如下。

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.5.3 总抗氧化能力测定

采用FANG等[15]的方法，配制0.1 mol/mL乙酸盐缓冲液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L 氯化铁（10∶1∶1，体积比）的铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）试剂，取 1 mL 杨梅汁并添加9 mL FRAP试剂，混合均匀后，37℃水浴10 min，在593 nm处测定吸光度，带入标准曲线Y=0.000 7X+0.058 5（R2=0.998 7），计算 FRAP 值。

1.6 数据分析

所有试验均重复3次，试验结果取平均值，数据采用Origin 2019与Design Expert 8.0.6进行数据分析和图表绘制。采用SPSS 17.0进行ANOVA单因素方差分析，并检验数据的差异显著性（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 复合酶制备杨梅汁单因素试验结果

2.1.1 果胶酶和纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响见图1。

图1 复合酶质量比对杨梅出汁率的影响Fig.1 Effect of compound enzyme mass ratio on juice yield of bayberry

有研究表明，适宜环境条件下，复合酶作用效率高于单一酶[19-21]。如图1所示，果胶酶与纤维素酶质量比为3∶1时，杨梅出汁率最高，为84.88%，显著高于果胶酶与纤维素酶作用下杨梅出汁率（P＜0.05），与ABOUELSEOUD等[22]、BIAN等[7]的研究结果相似。由此可知，果胶酶与纤维素酶质量比为3∶1时，为制备杨梅汁最适复合酶质量比。

2.1.2 复合酶添加量对杨梅出汁率的影响

复合酶添加量变化对杨梅出汁率的影响见图2。

图2 复合酶添加量对杨梅出汁率的影响Fig.2 Effect of compound enzyme additionon juice rate ofbayberry

由图2可知，随着复合酶添加量的升高，杨梅出汁率呈先上升后趋于平稳的趋势。复合酶添加量为0.25%～0.40%时，酶解过程加速杨梅细胞破碎，杨梅出汁率显著升高（P＜0.05），复合酶添加量为0.40%时，杨梅出汁率为84.91%，达到最大值，表明酶解作用完全；当复合酶添加量继续增加，底物缺失导致杨梅出汁率无显著变化（P＞0.05）。故复合酶添加量0.40%为制备杨梅汁的最适添加量。

2.1.3 酶解温度对杨梅出汁率的影响

酶解温度对杨梅出汁率的影响见图3。

图3 酶解温度对杨梅出汁率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on juice rate of bayberry

温度对酶活力影响较大，低温环境下酶活力会降低；高温环境下，酶结构会被破坏，使其失活，无法发挥作用[23]。由图3可知，当酶解温度为25℃～45℃时，杨梅出汁率随着温度变化显著上升（P＜0.05），并达到最大值为84.81%；继续升高酶解温度，杨梅出汁率开始下降。当酶解温度为75℃时，杨梅出汁率为81.62%，显著低于25℃条件下杨梅出汁率82.27%，表明在55℃～75℃温度环境下，复合酶易变性失活，无法提高杨梅出汁率。由此确定45℃为制备杨梅汁的最适酶解温度。

2.1.4 酶解时间对杨梅出汁率的影响

酶解时间对杨梅出汁率的影响见图4。

图4 酶解时间对杨梅出汁率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on juice rate of bayberry

酶解时间长短与实际工业化生产、经济效益和生产环境密切相关。由图4可知，在0～60 min，杨梅出汁率随着酶解时间的延长而升高，酶解时间为60 min时，杨梅果浆已酶解完全，杨梅出汁率达到最大值，为84.90%；在60 min～150 min时，杨梅出汁率无显著变化（P＞0.05）。由此确定60 min为制备杨梅汁最适酶解时间。

2.2 响应面法优化复合酶酶解工艺

2.2.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础上，选取复合酶添加量X1、酶解温度X2、酶解时间X3为因素，出汁率Y为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，测定结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 响应面数学模型建立与显著性检验

使用Design-Expert8.0.6统计分析软件对表2中的试验结果进行线性二次多项式回归拟合，建立二次多元回归方程：Y=85.28+0.18X1+0.16X2+0.18X3+0.12X1X2+0.088X1X3+0.040X2X3-0.82X12-0.65X22-0.17X32。模型和回归系数显著性检验见表3。

表3 模型和回归系数显著性检验Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

由表3可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P=0.106 3＞0.05，不显著；R2=0.989 0，R2Adj=0.974 8，说明该数学模型与试验结果拟合较好，试验值与预测值有着高度的相关性，各因素与响应值间线性关系显著，可用于杨梅出汁率理论预测。由F值检验可知，各因素对杨梅出汁率的影响大小顺序为复合酶添加量（X1）＞酶解时间（X3）＞酶解温度（X2）。

2.2.3 响应面分析

复合酶添加量、酶解温度和酶解时间的交互作用见图5。

图5 因素交互作用图Fig.5 Interaction of factors and contour map

3D图可直观地反映各因素对杨梅出汁率影响程度，由表3和图5可知，X1、X2、X3、X12、X22、X32对杨梅汁得率的影响极显著（P＜0.01），X1X2对杨梅汁得率的影响显著（P＜0.05），表明复合酶添加量与酶解温度交互作用显著。

通过响应面分析法获得杨梅酶解最优工艺条件为复合酶添加量0.408%、酶解温度46.59℃、酶解时间77.69 min，此条件下杨梅出汁率理论值为85.36%。为操作方便，将上诉条件修正为复合酶添加量0.40%、酶解温度45℃、酶解时间60 min，此条件下进行3次平行试验，测得杨梅出汁率为（85.27±0.12）%，与理论值非常接近，说明该模型可用于生产中杨梅出汁率的分析预测。

2.3 酶解对杨梅汁理化指标及营养与功能成分的影响

果胶酶能够降解细胞间的果胶质，将杨梅细胞从植物组织中分离出来。纤维素酶可破坏植物细胞壁，从而提高杨梅汁得率，两种酶共同作用有利于提高杨梅汁出汁率、提升杨梅汁的营养品质[8，19]。

2.3.1 酶解对杨梅汁pH值、总酸、可溶性固形物、浊度的影响

酶解前后杨梅汁理化指标的变化见表4。

表4 酶解前后杨梅汁理化指标的变化Table 4 Changes of physical and chemical indexes of bayberry juice before and after enzymatic hydrolysis

由表4可知，复合酶酶解后的杨梅汁总酸、可溶性固形物、浊度指标均显著增加（P＜0.05），可能是酶解后细胞破碎使有机酸、可溶性物质增加[22]，从而使总酸、可溶性固形物分别增加16.67%、9.20%。此外，总酸的增加导致pH值降低3.88%。浊度上升149.22%，分析可能是多数酶为蛋白质，添加后会增加浊度指数。

2.3.2 酶解对杨梅汁营养指标的影响

酶解对杨梅汁营养指标的影响如表5所示。

表5 酶解对杨梅汁营养指标的影响Table 5 Effects of enzymatic hydrolysis on nutritional indexes of bayberry juice mg/mL

植物细胞溶出会导致有机酸、蛋白质和多糖等营养物质含量上升，由表5可知，总糖、总多酚、总黄酮、花色苷、蛋白质均显著增加（P＜0.05），分别增加38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，分析可能是植物细胞破碎，蛋白酶的添加和部分多酚酸合成酶活性升高所致。由此可知，酶解制备所得杨梅汁可提高杨梅汁营养品质。

2.3.3 酶解对杨梅汁DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率及FRAP的影响

酶解对杨梅汁抗氧化能力的影响见表6。

表6 酶解对杨梅汁抗氧化能力的影响Table 6 Effects of enzymatic hydrolysis on antioxidant capacity of bayberry juice

酚类、黄酮类化合物是体外抗氧化能力的主要作用成分，其含量变化对抗氧化活性影响很大[23]。由表6可知，酶解汁的DPPH·清除率、FRAP值显著增加（P＜0.05），分别增加6.30%、69.03%，与多酚等物质含量上升有关。·OH清除率无显著变化（P＞0.05）。因此，酶解汁抗氧化能力的升高可能与多酚、黄酮等功能活性物质含量的变化有关。

2.3.4 酶解对杨梅汁色泽的影响

酶解对杨梅汁色泽的影响见表7。

表7 杨梅汁与酶解杨梅汁的色泽指标Table 7 Color measurements of bayberry juice and enzymolysis juice

复合酶处理后，酶解杨梅汁颜色明显加深。由表7可知，L值、a值、b值显著下降（P＜0.05），分别下降54.76%、57.91%、52.72%；CD 值、T值显著增加（P＜0.05），分别增加191.52%、19.45%，花色苷是紫红色的自然色素，其含量的显著增加使酶解汁色泽指标发生显著变化，酶解杨梅汁亮度变低红色加深，外观与蓝莓汁、黑莓汁类似[18]，更易被消费者接受；杨梅汁溶液的颜色是其对光的选择性吸收，CD值、T值显著上升也是颜色加深的重要表现。

3 结论

本研究以新鲜荸荠杨梅为原料，使用复合酶处理法提高杨梅出汁率，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化酶解工艺，并分析杨梅汁在复合酶处理前后理化指标与挥发性成分的差异性，并对酶解汁总酚、总黄酮、花色苷与抗氧化能力进行相关性分析。结果表明：各变量对杨梅出汁率的影响大小顺序为复合酶添加量（X1）＞酶解时间（X3）＞酶解温度（X2）；复合酶酶解最佳工艺为复合酶添加量0.40%、酶解温度45℃、酶解时间60 min，在此工艺条件下杨梅出汁率为85.27%；酶解杨梅汁的营养指标总糖、总酚、总黄酮、花色苷、蛋白质在复合酶处理后显著上升（P＜0.05），分别增加了38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，DPPH·清除率、FRAP值分别显著增加6.30%、69.03%（P＜0.05），·OH清除率无显著变化，色泽指标L值、a值、b值分别显著下降 54.76%、57.91%、52.72%（P＜0.05），CD 值、T 值上升 191.52%、19.45%（P＜0.05）。

复合酶处理制备杨梅汁，可综合提高杨梅汁的营养指标、抗氧化能力、色泽等，是杨梅深加工的重要手段，后续试验将对其沉淀、褐变以及感官评价方面加深研究。